Автореферат-Ермаковой+АВ-19_11_13-1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Согласно современным представлениям, анаэробное превращение практически любого сложного органического вещества в биогаз проходит несколько последовательных стадий: гидролиз, ферментация, ацетогенез и метаногенез. Весь этот сложный комплекс превращений осуществляет микробное сообщество, включающее, по некоторым оценкам, – до нескольких сотен видов (Gujer & Zehnder, 1983; Заварзин, 1986). Летучие жирные кислоты (ЛЖК) являются важными интермедиатами анаэробной деградации органических веществ. В пресноводных экосистемах (природных и антропогенных) деградация ЛЖК невозможна без участия синтрофных бактерий, так как изменение свободной энергии Гиббса при окислении ЛЖК является положительной величиной (Stams, 1994). Такие реакции термодинамически невозможны. Для осуществления реакции окисления ЛЖК необходимо снижение концентрации водорода, образующегося в процессе окисления ЛЖК до 1-10 Па (10-4 атм). Низкую остаточную концентрацию водорода в пресноводных экосистемах обеспечивают водородиспользующие метаногены (McInerney et al., 2008). Научный интерес к метаногенным сообществам, функционирующим при пониженных температурах, обусловлен большой экологической значимостью низкотемпературных микробных экосистем в биосфере Земли.

Традиционно в России сточные воды очищают в аэротенках и реже – в анаэробных биореакторах. Эти методы имеют достоинства и недостатки. При анаэробной обработке сточных вод образуется на порядок меньше биомассы, однако, анаэробная очистка в реакторах с восходящим потоком среды проводится в основном в мезофильных (30–35°С) и термофильных (50–55°С) условиях и поэтому связана с большими энергозатратами на поддержание определенной температуры в реакторах, что делает этот процесс дорогим. Для снижения энергозатрат перспективной является разработка эффективной технологии анаэробной предобработки концентрированных стоков при температуре окружающей среды без обогрева реактора или с подогревом до 20–25°С. Эффективная очистка в таких условиях может быть достигнута при развитии сбалансированного психроактивного микробного сообщества. В анаэробных биореакторах с подачей очищаемой воды снизу (UASB, EGSB), благодаря гидродинамическим условиям, микроорганизмы образуют агрегаты (гранулы), в которых происходит межвидовой перенос водорода между синтрофными бактериями, окисляющими ЛЖК, и водородиспользующими метаногенами. В метаногенном сообществе между группами микроорганизмов существуют тесные и сложные

1

взаимосвязи, в том числе, и обратные. Ввиду субстратной специфичности метаногенов, их рост невозможен без трофической связи с бактериями предыдущих стадий. В свою очередь, метаногены, используя вещества, продуцируемые первичными анаэробами, определяют скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Выявление особенностей регуляции низкотемпературного метаногенного сообщества, выделение и изучение физиологии микроорганизмов, входящих в его состав, необходимо для прогнозирования поведения микробных сообществ в холодных природных экосистемах, особенно находящихся под сильным антропогенным воздействием.

Цели и задачи исследования

Целью работы было исследование психроактивных синтрофных метаногенных сообществ, окисляющих летучие жирные кислоты (пропионат и бутират), выделение и описание метаногенов из низкотемпературных антропогенных мест обитания.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1)исследование метаболической устойчивости психроактивного микробного сообщества анаэробного биореактора к временному повышению или понижению температуры при периодическом культивировании;

2)получение пропионат- и бутират-окисляющих психроактивных микробных консорциумов, изучение их температурных характеристик и микробного состава;

3)выделение и описание психроактивного метаногена из упомянутых синтрофных консорциумов;

4)выделение и описание психроактивных метаногенов из придонных проб заглубленного навозохранилища свинофермы, с температурой in situ ниже 10°С.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые исследованы адаптационные возможности биомассы низкотемпературного анаэробного биореактора к временным изменениям температуры. Выявлено, что инкубирование психроактивной биомассы в течение 45-60 суток при температуре 30°С улучшает ее активность при переносе на 10°С.

Впервые из биомассы низкотемпературного анаэробного биореактора получены устойчивые синтрофные пропионат- и бутират-окисляющие психроактивные метаногенные консорциумы, растущие при пониженной температуре, и исследован их микробный состав.

2

Показана различная таксономическая принадлежность бактерий, составляющих низкотемпературный и мезофильный консорциумы. Обнаружено, что большинство бактерий низкотемпературных консорциумов принадлежат к новым таксонам.

Впервые из антропогенных местообитаний – анаэробного реактора и заглубленного навозохранилища, выделены новые психроактивные метаногены. Выделен и описан первый психроактивный гидрогенотрофный метаноген рода

Methanospirillum - Methanospirillum stamsii Pt1Т из пропионат-окисляющего консорциума. Выделен и описан новый психроактивный вид рода Methanosarcinа - «Methanosarcina porcellina Pr2T» и его референтный штамм «Methanosarcina porcellina

Pr1» из накопительной культуры, полученной из свиного навоза. Выделена и частично охарактеризована бактерия-спутник нового вида метаносарцины, представляющая собой новый вид рода Sphaerochaeta sp. штамм PS.

Данные, полученные при исследовании исходной биомассы из анаэробного биореактора, полученных пропионат- и бутират-окисляющих консорциумов, выделенных и описанных новых видов метаногенов расширяют знания о составе, структурных и метаболических взаимоотношениях в низкотемпературных анаэробных антропогенных микробных сообществах. Полученные результаты могут быть использованы для создания новых экономичных технологий очистки муниципальных и промышленных концентрированных стоков, получения биотоплива, выделения ферментов, активных при температуре окружающей среды (10–20°С).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях –

«2-nd FEMS Congress of European Microbiologists» в Мадриде (Испания, 2006), на 12-м

международном Симпозиуме по микробной экологии ISME-12 в Кернсе (Австралия, 2008), на IV Всероссийской молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008) и на IX Молодежной школе-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2013).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 экспериментальные статьи и 4 тезисов.

3

Место проведения работы

Работа выполнена в лаборатории микробиологии антропогенных мест обитания Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук. Молекулярнобиологические исследования проводили в центре коллективного пользования ИНМИ РАН, в Центре «Биоинженерия» РАН и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета микробиологии Университета г. Хельсинки (Финляндия).

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. С.Н. Паршиной за научное руководство и помощь в работе, благодарит сотрудников ИНМИ РАН д.б.н., зав. лабораторией А.Н. Ножевникову, к.б.н. А.Ю. Каллистову, к.б.н. Е.Н. Деткову, к.б.н. А.К. Кизилову, Н.А. Кострикину, сотрудников кабинета газохроматографического анализа, сотрудников центра коллективного пользования, сотрудников Центра «Биоинженерия» РАН за практическую помощь и ценные советы.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 134 страницах машинописного текста и включают 35 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы, состоящий из 220 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили (1) адаптированная к низкой температуре гранулированная метаногенная микробная биомасса, полученная из лабораторного двустадийного EGSB реактора (Университет Вагенингена, Нидерланды), обрабатывавшего модельную сточную воду с летучими жирными кислотами - ацетатом, пропионатом и бутиратом в качестве источника углерода и энергии при температуре 4– 12°С (Rebac et al., 1995; Lettinga et al., 1999); (2) накопительные культуры двух морфотипов метаносарцин, выделенных из жидких стоков свинофермы, расположенной в северной части Крымской области (поселок Нижнегорск, Украина). Пробы для выделения отбирали со дна навозохранилища, где температура была ниже 10°С.

4

Синтрофные консорциумы, накопительные и чистые культуры микроорганизмов культивировали с использованием минеральных сред, описанных в публикациях (1, 2), с добавлением дрожжевого экстракта (0.2–0.5 г/л) и (при работе с чистыми культурами метаногенов) казаминовых кислот (5–10 г/л). Для работы с синтрофными консорциумами в качестве субстратов использовали раздельно пропионат и бутират (10–20 ммоль/л). Для определения спектра субстратов, используемых чистыми культурами метаногенов, применяли триметиламин, диметиламин, монометиламин, метанол, формиат, ацетат, лактат, бутанол, этанол, ацетон, бетаин, кротонат, пируват в концентрации 10–20 ммоль/л и смесь водорода и углекислого газа (80:20). Культивирование проводили при температуре 1, 5, 10, 18, 21, 25, 30, 35, 40, 50°С, в присутствии 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 М NaCl и в интервале рН от 4.0 до 10.0.

Выделение накопительных и чистых культур метаногенов проводили методом серийных разведений, получением колоний по методу roll-tubes (в пробирках Хангейта или в пенициллиновых флаконах с тонким слоем 2% агаризованной среды), посевом на разные субстраты, культивированием при разных температурах. При выделении использовали антибиотики: ванкомицин (100–200 мг/л), пенициллин (2 мг/л), стрептомицин (200 мг/л), канамицин (100 мг/л), хлорамфеникол (100 мг/л), ампициллин (1 г/л), циклосерин (100 мг/л), эритромицин (100 мг/л), рифампицин (100 мг/л). О чистоте культуры судили по результатам микроскопирования, отсутствию роста на глюкозо-пептонной среде, а также с помощью молекулярно-биологических методов (ПЦР - амплификация с бактериальными и архейными праймерами и секвенирование). Для ДНК-ДНК гибридизации использовали типовые штаммы Methanospirillum hungatei

JF1T и Methanosarcina lacustris ZST.

Микроскопические методы исследования

Микроскопирование проводили с помощью микроскопов МБИ-3 и Axiolmager D1 (CarlZeiss, Германия). Электронные фотографии получали на микроскопе JEOL 100C XII (Япония).

Газожидкостная хроматография

Летучие жирные кислоты определяли методом газоадсорбционной хроматографии на хроматографе Chrom 5 (Прага, Чехия) с пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента использовали Хромосорб-101. Температура детектора и испарителя – 170 и 230°С соответственно. Расходы водорода и воздуха составляли 30 и 300 мл/мин соответственно. Расход газа-носителя (аргона) – 40 мл/мин. Пробу культуральной

5

жидкости предварительно центрифугировали (10000 об/мин, 10 мин). Супернатант подкисляли 10%-й Н3РО4 до рН 2.

Анализ газов проводили на хроматографе ГХ 3700 (сорбент Porapak Q) и Кристалл 5000.1 (сорбент Хромосорб 102) с пламенно-ионизационным детектором (Россия). Температура колонок – комнатная; газ-носитель – аргон, расход газа – 40 мл/мин. Ток накала нити 80 мА. Использовали стеклянные колонки длиной 1.2 м и внутренним диаметром – 3 мм.

Молекулярно-биологические методы

Выделение ДНК чистых культур, ПЦР-амплификацию генов 16S рРНК и mcrA, гель-электрофорез, очистку продуктов ПЦР, секвенирование, определение содержания Г+Ц пар оснований в ДНК, ДНК-ДНК гибридизацию проводили, как описано в публикации (2). При выделении ДНК метаносарцин биомассу дополнительно растирали в ступке с жидким азотом 2–4 раза.

Выделение тотальной ДНК синтрофного консорциума проводили методом, основанным на использовании гексадецилтриметиламмоний бромида (Wilson et al., 1989). Амплификацию генов 16S рРНК чистых культур проводили с использованием универсальных бактериальных 8-27F/1492R и универсальных архейных 8fa/1492R праймеров. ДНК-фрагменты, полученные при амплификации образцов ДНК с бактериальными праймерами GC984F/1492R и архейными праймерами GCArch3F/519R, разделяли методом денатурирующего градиентного гельэлектрофореза (ДГГЭ) в 6% акриламидном геле, с содержанием линейного градиента (от 30 до 60%) ДНК-денатурантов (смесь мочевины и формамида) по стандартной методике (Muyzer et al., 1993). Последующую амплификацию проводили с бактериальными праймерами 984F/1492R и архейными праймерами Arch3F/519R. Ген mcrA амплифицировали с использованием праймеров MLF/MLR, mlas/mcrA-rev. Продукты амплификации секвенировали по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) с

помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc., USA) на генетическом анализаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc., USA). Обработку полученных хроматограмм проводили с помощью программы Chromas, версия 1.45. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Построение филогенетических деревьев проводили с помощью программы Geneious Pro (v 6.1, Biomatters, New Zealand).

6

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.Исследование метаболической устойчивости биомассы к изменениям температуры культивирования

Ранее было показано, что продуктивность разложения ЛЖК гранулированной биомассой низкотемпературного анаэробного биореактора (4–12°С), использованной для наших исследований, была сравнима с продуктивностью мезофильного реактора (Lettinga et al., 1999). В природных условиях или при эксплуатации биогазовых установок, в том числе низкотемпературных, температура культивирования может меняться. Поэтому было важно исследовать степень метаболической устойчивости психроактивного микробного сообщества к временному повышению (30°С) или вторичному понижению (до 10°С) температуры при периодическом культивировании (Паршина с соавт., 2011).

Биомассу из ферментера в течение нескольких лет хранили в стеклянном флаконе объемом 140 мл при 10°С. Для данного эксперимента биомассу гомогенизировали в стеклянной ступке под током азота для более равномерного внесения во флаконы с питательной средой с пропионатом (10 ммоль/л) и отдельно с бутиратом (10 ммоль/л). Инкубацию проводили при 10°С и 30°С. При температуре 30°С флаконы находились разные промежутки времени: 48 суток, 84 суток и 150 суток с дальнейшим возвращением на температуру 10°С. В результате проведенного исследования было показано, что инкубирование биомассы в течение относительно короткого времени (48 суток) при температуре 30°С не ухудшало её активность при 10°С. Однако долговременное культивирование биомассы при 30°С приводило к её адаптации к мезофильным условиям и высокой продуктивности разложения органического вещества при этой температуре. Полученные результаты свидетельствует о присутствии в сообществе как мезофильных, так и психроактивных микроорганизмов. При культивировании более двух-трех месяцев при 30°С мезофильные микроорганизмы, вероятно, замещают психроактивные.

2.Получение синтрофных метаногенных консорциумов на пропионате и бутирате

Биомассу из анаэробного биореактора в течение нескольких лет поддерживали методом последовательных пересевов при 10°С на средах с пропионатом и бутиратом раздельно, чётко соблюдая линию каждого субстрата. В результате на каждом из субстратов были получены метаногенные консорциумы. Микроскопирование

7

обнаруживало присутствие в каждом из них 5-7 морфологически различных микроорганизмов (рис. 1 а, б).

Рис. 1.

Микрофотография пропионатокисляющего (а) и бутиратокисляющего (б) консорциумов. Шкала 10 мкм.

Несмотря на культивирование в периодических условиях, многократные пересевы и, видимо, связанное с этим постепенное элиминирование части микроорганизмов, не принимавших непосредственного участия в синтрофном окислении, микроорганизмы консорциумов не потеряли способность к образованию агрегатов, что является важным свойством для их сбалансированного функционирования (рис. 1 а, б).

Консорциумы, развивавшиеся на средах с бутиратом и пропионатом, кроме бактерий, содержали клетки в форме длинных изогнутых нитей, морфологически сходные с ацетокластическим метаногеном Methanosaeta, и более короткие изогнутые палочки, морфологически сходные с Methanospirillum, причем на бутирате было больше Methanosaeta sp., а на пропионате – Methanospirillum sp. (рис. 1 а, б). В

агрегатах также были обнаружены клетки метаногена, образующего тетрады из кокковидных клеток, морфологически сходного с Methanomethylovorans sp. (на бутирате в большем количестве, чем на пропионате) (рис. 1 б).

3.Исследование влияния температуры на потребление пропионата и бутирата метаногенными консорциумами

Пропионат- и бутират-окисляющие консорциумы культивировали при температуре 10, 20, 30 и 40°С. Показано, что пропионат не потребляется синтрофным консорциумом при 30 и 40°С. Оптимальной температурой для потребления пропионата является температура 20°С (рис. 2 а). Инкубирование при 10°С приводило к окислению пропионата, но с временным накоплением ацетата (рис. 2 б). Пропионат-окисляющий консорциум потерял свою способность к росту при 30°С, очевидно, из-за многократных пересевов при температуре 10°С, приведших к низкотемпературной селекции психроактивных микроорганизмов.

8