Автореферат-Ермаковой+АВ-19_11_13-1

Совокупность физиологических и молекулярно-биологических характеристик штаммов Pr1 и Pr2T, позволяет штамм Pr2Т отнести к новому виду «Methanosarcina porcellina Pr2T» sp. nov., а штамм Pr1 является референтным штаммом вида «Methanosarcina porcellina Pr1». Сравнительные характеристики штаммов Pr1, Pr2Т и Methanosarcina lacustris ZSТ приведены в таблице 4. На сегодняшний день из природных мест обитания выделены и описаны 10 видов психрофильных и психроактивных метаногенов. Из них 3 психроактивных вида, принадлежащих к роду

Methanosarcinа: Methanosarcina baltica, Methanosarcina lacustris и Methanosarcina soligelidi. Нами был выделен из антропогенного места обитания и описан новый психроактивный вид этого рода «Methanosarcina porcellina Pr2T» sp. nov. и его референтный штамм «Methanosarcina porcellina Pr1».

6.2. Выделение и определение филогенетического положения Sphaerochaeta sp. штамм PS

Спутником обоих штаммов метаносарцин (Pr1 и Pr2T) была кокковидная бактерия с полиморфной морфологией (рис. 12 а), которая росла на гликокаликсе метаносарцин

(рис. 12 б).

Рис. 12. Микрофотография Sphaerochaeta sp. штамм PS в чистой культуре (а) и в культуре

Methanosarcina sp. штамм Pr1 (б). Шкала 10 мкм.

Методом серийных разведений накопительных культур метаносарцин на среде с мальтозой и дрожжевым экстрактом была выделена чистая культура этой бактерииспутника.

Сравнение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерии-спутника с базой данных показало, что она принадлежит к новому виду рода Sphaerochaeta и

19

имеет 96% сходства с геном 16S рРНК S. pleomorpha - ближайшим родственным микроорганизмом (рис. 13).

Род Sphaerochaeta включает в себя три вида: S. globosa, S. pleomorpha и S.

сoccoides (перенесенную недавно из рода Spirochaeta, бывший вид Spirochaeta сoccoides). Штамм Sphaerochaeta sp. PS был депонирован в международных коллекциях под номерами DSM 26296 и VKM B-2809.

Рис. 13. Филогенетическое положение Sphaerochaeta sp. штамма PS на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с постоянно ухудшающейся экологической обстановкой на планете и возрастающей необходимостью утилизации отходов, необходимо изучение функционирования микробных сообществ антропогенных мест обитания для уменьшения негативного влияния промышленных и бытовых загрязнений и регулирования работы очистных сооружений. Для изучения была использована

20

микробная биомасса из двух антропогенных мест обитания, функционировавших при пониженных температурах – анаэробного низкотемпературного EGSB биореактора, разлагавшего ЛЖК (ацетат, пропионат, бутират) при температуре 3-12°С и навозохранилища свинофермы, на дне которого среднегодовая температура не превышала 10°С.

Способность микробного сообщества адаптироваться к изменениям окружающей среды зависит от физиологических свойств каждого члена сообщества в отдельности и от сбалансированности работы сообщества в целом. Исследование метаболической устойчивости биомассы анаэробного EGSB биореактора показало, что в сообществе, несмотря на длительную адаптацию к низким температурам, присутствуют как психроактивные, так и мезофильные микроорганизмы. При длительном культивировании в мезофильных условиях психроактивные свойства биомассы утрачиваются, однако кратковременное культивирование (1.5-2 месяца) при температуре 30°С даже улучшает последующее функционирование психроактивной микробной биомассы при температуре 10°С.

Для определения микробного состава и физиологических свойств микроорганизмов, участвующих в окислении пропионата и бутирата при низкой температуре, из исходной биомассы EGSB биореактора, содержавшей от нескольких десятков до нескольких сотен видов микроорганизмов, были получены консорциумы отдельно на пропионате и бутирате, содержавшие 5-7 микроорганизмов, непосредственно участвовавших в окислении конкретной ЛЖК. Следует отметить, что подавляющее число синтрофных бактерий способны окислять либо пропионат, либо бутират. В результате исследования температурных диапазонов роста консорциумов было выявлено, что пропионат-окисляющий консорциум обладал более низкой оптимальной температурой по сравнению с бутират-окисляющим. По-видимому, пропионат-окисляющая синтрофная бактерия имела более низкие пределы температуры роста, чем бутират-окисляющая.

Микроскопирование показало, что в пропионат-окисляющем консорциуме было больше клеток гидрогенотрофного метаногена Methanospirillum, а в бутиратокисляющем – ацетокластического метаногена Methanosaeta. Такое соотношение соответствует стехиометрии реакций окисления пропионата и бутирата. В первом случае образуется больше водорода и меньше ацетата, а во втором – наоборот. Очевидно, что для функционирования при температуре 10°С члены консорциума должны быть психроактивными. Анализ архейной составляющей консорциумов методом ДГГЭ показал присутствие трех видов метаногенов с 98-100% сходства последовательностей генов 16S рРНК с Methanosaeta, Methanomethylovorans и 97.5%

сходства с геном Methanospirillum. Выделенный нами штамм Methanospirillum sp.

21

оказался психроактивным (способен расти при температуре 5-10°С). Он был описан нами как новый вид Methanospirillum stamsii Pt1Т.

При анализе бактериальной составляющей консорциумов методом ДГГЭ, нами были обнаружены последовательности генов 16S рРНК представителей типов

Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Spirochaetes, что характерно для биомассы анаэробных биореакторов, в том числе низкотемпературных (Grabowsky et al., 2005; McKeon et al., 2009). Полученные последовательности генов 16S рРНК, имели отдаленное родство с последовательностями генов пропионат-окислящей бактерии

Smithella propionica (97%), бутират-окисляющей бактерии Syntrophomonas bryantii (96%), сахаролитическими бактериями Macellibacteroides fermentans (98%) и Acetivibrio multivorans (81%). Кроме того, секвенированием генов 16S рРНК было установлено, что консорциумы содержали бактерии, сходные с некультивируемыми до настоящего времени бактериями. Интересно, что многие из них были обнаружены в различных низкотемпературных природных (Арктика, Антарктика) и антропогенных (психрофильные анаэробные биореакторы, низкотемпературное нефтяное хранилище) местах обитания. Чрезвычайно важным является выделение в будущем обнаруженных бактерий (и синтрофов, и их спутников) в чистые культуры. Среди них могут оказаться совершенно новые психроактивные бактерии.

Из второго низкотемпературного антропогенного источника – свиного навоза, был выделен и описан новый психроактивный вид «Methanosarcina porcellina Pr2T» sp. nov.

иштамм Pr1 являющийся референтным штаммом вида «Methanosarcina porcellina Pr1». Штаммы Pr1 и Pr2T были отнесены к новому виду «Methanosarcina porcellina», несмотря на 99.9% сходства последовательностей их генов 16S рРНК с геном Methanosarcina lacustris ZSТ, так как ДНК-ДНК-гибридизация этих штаммов с Methanosarcina lacustris ZSТ показала 53 и 42%, соответственно, а друг с другом 79%. Известно, что несколько изолятов метаногенов при 99-100%-ном сходстве последовательностей генов 16S рРНК были отнесены к новым видам на основании данных ДНК-ДНК гибридизации (Singh et al., 2005; Krivushin et al., 2010; Wagner, 2013)

инекоторых физиологических различий. Новый метаноген и его референтный штамм – первые психроактивные штаммы, выделенные из антропогенного источника, а не природного местообитания.

Выделенная бактерия – спутник «Methanosarcina porcellina Pr1», также оказалась новым видом рода Sphaerochaeta sp. штамм PS.

Таким образом, нами установлено, что в холодных условия идет длительный, но устойчивый процесс разложения органического вещества сложным сообществом микроорганизмов, многие из которых принадлежат к новым таксонам. Знания об этих

22

сообществах и микроорганизмах необходимы для понимания функционирования низкотемпературных природных и антропогенных микробных экосистем.

ВЫВОДЫ

1.Изучение метаболической устойчивости психроактивного синтрофного ЛЖКокисляющего сообщества анаэробного биореактора к временному изменению температуры культивирования показало, что оно устойчиво к непродолжительному (1.5-2 месяца) культивированию при 30°С, которое способствует приросту психроактивных микроорганизмов и повышает их активность при последующем переносе на 10°С. При более длительном культивировании при 30оС мезофильные микроорганизмы, вероятно, замещают психроактивные. Для ускорения накопления психроактивного инокулята к запуску низкотемпературных биореакторов может быть использовано только непродолжительное повышение температуры.

2.Получены устойчивые психроактивные метаногенные консорциумы, разлагающие пропионат и бутират, и показаны различия в таксономической принадлежности составляющих их бактерий, большинство из которых принадлежит к новым таксонам.

3.В пропионат- и бутират-окисляющих консорциумах присутствуют одни и те же психроактивные метаногенные археи – представители родов Methanosaeta,

Methanospirillum и Methanomethylovorans. Различия в количестве гидрогенотрофных и ацетокластических метаногенов в консорциумах соответствовали стехиометрии реакций окисления (количеству образующихся водорода и ацетата при окислении пропионата или бутирата).

4.Из психроактивных синтрофных консорциумов, полученных из гранулированного активного ила анаэробного реактора, работавшего при 4-12оС, выделен и описан первый психроактивный гидрогенотрофный метаноген рода

Methanospirillum - Methanospirillum stamsii sp. nov. c типовым штаммом Pt1Т (=DSM 26304T, =VKM B-2808T)

5.Впервые из антропогенного источника – придонной части открытого заглубленного навозохранилища свинофермы, выделены и описаны два штамма психроактивных метаногенов, представляющих новый вид «Methanosarcina porcellina» sp. nov. с типовым штаммомPr2T (=DSM 15218Т, = VKM B-2806Т ).

6.Выделен бактериальный спутник психроактивной метаносарцины Methanosarcina porcellina Pr1T – Sphaerochaeta sp. штамм PS, который является представителем нового вида рода Sphaerochaeta (=DSM 26296, =VKM B-2809)

23