Часть I. Общая нозология

надобятся R-логические, ультразвуковые, оф­тальмоскопические и некоторые другие паракли­нические методы исследования. Однако оконча­тельная диагностика и выявление более тонких генетических вариантов исследованной патоло­гии осуществляются с применением специаль­ных лабораторных методов диагностики.

Лабораторные методы диагностики. Ла­бораторная диагностика наследственных болез­ней (фено- или генотипирование индивидов) в основе своей может быть направлена на иденти­фикацию одной из трех «ступеней» болезни. Во-первых, это выявление этиологической причи­ны наследственной патологии, или характерис­тика генотипа, т.е. определение конкретной му­тации у индивида (генной, хромосомной, геном­ной). Эти цели достигаются с помощью цитоге-нетических или молекулярно-генетических ме­тодов. Во-вторых, лабораторные методы позво­ляют регистрировать первичный продукт гена (биохимические, иммунологические методы). В-третьих, возможна регистрация специфичес­ких метаболитов измененного обмена, возник­ших в процессе реализации патологического дей­ствия мутации (биохимические, иммунологичес­кие, цитологические методы регистрации на уровне жидкостей - кровь, моча, секрет или кле­ток).

Цитогенетические методы. Они предназна­чены для изучения структуры хромосомного на­бора или отдельных хромосом. Объектом цито-генетических наблюдений могут быть делящие­ся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Чаще исследования выполняются на соматических клетках: наиболее удобный объект - культура лимфоцитов периферической крови, но также и культура клеток из кусочков кожи (фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидко­сти.

Специальным образом полученные препара­ты из культуры клеток затем окрашиваются. Все методы окраски препаратов можно разделить на три группы: простые, дифференциальные, флю­оресцентные.

Простая окраска (метод окраски по Гимзе или в русскоязычной литературе - «рутинная окрас­ка») используется для ориентировочного опре­деления числовых аномалий кариотипа. Струк-гурвые хромосомные аномалии (делеции, транс-юкации, инверсии), выявленные при простой ок-

раске, должны быть идентифицированы с помо­щью дифференциальной окраски. Под этим ме­тодом понимают способность хромосом к изби­рательному окрашиванию по длине с фиксаци­ей в виде чередования эу- и гетерохроматичес­ких районов (темные и светлые полосы).

Благодаря успехам в молекулярной генетике человека разработан принципиально новый ме­тод изучения хромосом - метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Он основан на ис­пользовании однонитевого специфического уча­стка ДНК («зонда»), специальным образом «по­меченного» и способного, после присоединения к участку анализируемой хромосомы, присоеди­нить флюоресцентные красители (красный, зе­леный и другие цвета). С помощью люминесцен­тного микроскопа окрашенные хромосомы ви­зуализируются на фоне неокрашенных. Метод позволяет расшифровать сложные хромосомные перестройки, а также локализовать ген.

Биохимические методы. Эти методы направ­лены на выявление биохимического фенотипа организма - от первичного продукта гена (поли­пептидной цепи) до конечных метаболитов в моче или поте. Поэтому существует огромное разно­образие методов. Но для целей диагностики на­следственных болезней оправданными являют­ся две биохимические стратегии, которые позво­ляют определить дальнейший ход обследования и выбор соответствующих биохимических мето­дов и тестов: массовые и селективные програм­мы первичной биохимической диагностики на­следственных болезней.

Массовые просеивающие программы приме­няются в диагностике фенилкетонурии, врож­денного гипотиреоза, адреногенитального синд­рома, врожденных аномалий нервной трубки и болезни Дауна. Селективные диагностические программы предусматривают проверку, уточне­ние биохимических аномалий обмена для паци­ентов, у которых подозреваются генные болез­ни, используя простые качественные реакции или более точные методы (тонкослойная хрома­тография мочи и крови, газовая хроматография, флюорометрические методики и др.).

Молекулярно-генетические методы. Это большая и разнообразная группа методов, пред­назначенных для выявления вариаций в струк­туре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки пер­вичной последовательности нуклеотидных осно-

"лава 4 / РОЛЬ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ, КОНСТИТУЦИИ И ВОЗРАСТА В ПАТОЛОГИИ

131

Таблица 19 Подходы к ДНК-диагностике наследственных болезней

Прямая диагностика мутаций

- Детекция крупных перестроек (мутаций) генов методами блот-гибридизации с исполь­ зованием ДНК-зондов; - выявление крупных и мелких делеций генов ПЦР-амплификацией отдельных фрагмен­ тов, в том числе мультиплексной ПЦР; - детекция внутригенных мутаций, изменяющих сайты узнавания определенных рестрик- таз (и вследствие этого - размер фрагментов, выявляемых блот-гибридизацией или ПЦР-амплификацией); - аллель-специфическая гибридизация (амплификация) с использованием олигонуклео- тидов, комплементарных нормальной или мутантной последовательности ДНК; - детекция конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (single strand conformation polymorphism); - метод детекции ошибок спаривания (cleavage mismatch detection); - гетеродуплексный анализ фрагментов гена; - секвенирование гена или его фрагмента

Косвенная (непрямая) молекулярная диагностика

Анализ косегрегации генетических маркеров (микро- и минисателлиты, ПДРФ), сцеплен­ных с патологическим геном, и болезни в семьях

ваний. Все разнообразие подходов для иденти­фикации генов или определенных фрагментов ДНК и их вариаций основывается на двух ос­новных методических разработках - технологии блот-гибридизации и амплификации отдельных участков ДНК.

Общая схема блот-гибридизации по Саузерну представлена на рис. 33 (метод назван по имени

Авторадиография

Детекция флуоресцентной метки Рис. 33. Блот-гибридизация по Саузерну

доктора из Эдинбурга Эдмунда Саузерна, а анг­лийское blot означает промокать).

В основу методики амплификации положена полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет в течение нескольких часов выделить и размножить определенный фрагмент ДНК в количестве, превышающем исходное в 10^е раз. Такая высокая степень направленного обогаще­ния значительно упрощает работу с минималь­ными количествами ДНК-образцов. Реакция высоко специфична и чувствительна, позволяет исследовать единичную копию гена в исходном материале.

В табл.19 приводятся другие методы геноти-пирования, основанные главным образом на этих же двух технологиях, а также обозначены под­ходы к ДНК-диагностике болезней (прямая и косвенная диагностика).

Методы моделирования. Как и в других раз­делах биологии и медицины, в генетике челове­ка и медицинской генетике широко применяют­ся методы моделирования. Они разделяются на две группы: биологические и математические.

Для изучения многих моногенных болезней человека используются животные, несущие му­тации в гомологичных генах. Они являются удоб­ными моделями для исследования молекуляр­ных основ патогенеза и отработки оптимальных вариантов лечения. С этой целью во многих пи­томниках мира созданы и поддерживаются кол­лекции генетических линий животных (мышей, крыс, кроликов, собак и др.). Мировая коллек­ция мышей насчитывает несколько сотен линий с моногенно наследуемыми дефектами.

132