Методичкапо Микробиологии

от больных в стационаре.

Для этого микробы, выделенные из больничной среды и от больных данного отделения, помещают на 10 минут в растворы дезинфектантов и антисептиков. Затем отмывают и помещают в МПБ. Если отмечается рост микроба – это клинически устойчивый штамм, и применять данные препараты в отделении нецелесообразно.

Даны для исследования 5 клинических штаммов – возбудителей гнойно-септических заболеваний и 5 антисептиков и дезинфектантов. Определить к каким препаратам наиболее часто определяется устойчивость. Все сведения по данной работе внести в общую таблицу и проанализировать.

Задание №4. Определить чувствительность различных видов бактерий к нескольким антисептикам.

Для этого микроб-возбудитель засевается на чашку Петри с МПА газоном. На посев наносят по капле исследуемые антисептики. Если микроб чувствителен к данному антисептику, то в месте его нанесения образуется стерильная зона – отсутствие роста бактерий.

Даны культуры кишечной, синегнойной палочки, капсульной палочки и золотистого стафилококка и 5 антисептиков. Учесть результаты чувствительности и занести их в таблицу. Полученные данные проанализировать.

Задание №5. Проведение бензидиновой пробы. Она ставится для выявления следов белка в инъекционных аппаратах после проведения предстерилизационной подготовки и стерилизации.

Для этого игла промывается дистиллированной водой (1мл) и капля воды наносится на фильтровальную бумагу. Сюда же наносят 3 капли бензидина 0,3% и 3 капли 3% перекиси водорода. При наличии белка на месте нанесения капель появляется пятна синего или зеленого цвета.

ЗАНЯТИЕ №13

Тема: Бактериофаги, их природа, строение, формы существования, механизмы взаимодействия

сбактериальными клетками Вопросы для подготовки

1.Бактериофаги, их природа, строение, формы существования.

2.Типы взаимодействия бактериофагов с бактериальной клет-

31

кой. Лизогения, лизогенная конверсия.

3.Методы культивирования и титрования бактериофагов (по Грациа и Аппельману).

4.Практическое использование бактериофагов в диагностике:

а) для индикации бактерий б) для идентификации бактерий

в) для установления идентичности культур бактерий, выделенных из разных источников, при эпидемиологическом анализе ситуации

5. Лечебно-профилактическое использование бактериофагов.

Задания к практической работе студентов

Задание №1. Провести титрование и индикацию дизентерийного бактериофага. Для приготовления биопрепаратов из бактериофагов используют в основном три источника:

1.лизогенные культуры бактерий

2.фекалии выздоравливающих больных

3.сточные воды

Допустим, необходимо выделить дизентерийный бактериофаг из сточных вод. На первом этапе проводят индикацию дизентерийного бактериофага в сточных водах методом фаговой дорожки:

а) на чашку Петри с МПА засевают газоном культуру дизентерийных бактерий, затем на поверхность посева закапывают фильтрат сточной воды стекающей каплей. Посевы инкубируют в термостате в течение 18 часов. Учесть результаты по готовым демонстрационным посевам.

При положительном ответе проводят определение исходного титра бактериофага по Аппельману.

б) Для титрования фага готовят его десятикратные разведения, в которые добавляют эталонную культуру дизентерийных бактерий (2 млрд. м.т. в 1 мл). Пробирки помещают в термостат на сутки.

Учесть исходный титр бактериофага.

в) Если титр недостаточен (необходимый титр для лечебных бактериофагов должен быть не менее 10-8), бактериофаги несколько раз пассируются на дизентерийных клетках, а затем вновь титруются. Учесть титр бактериофага после пассирования, сделать заключение.

Примечание: при достижении необходимого титра бактериофаг

32

стерилизуется фильтрованием через бактериальные фильтры, проходит контроль на стерильность и расфасовывается в стерильные ампулы или флаконы.

Задание №2. По готовым посевам определить титр дизентерийного бактериофага по Грациа. Для этого готовят десятикратные разведения фага, которые смешивают со стандартной культурой дизентерийных бактерий в объеме 0,1 мл каждое разведение бактериофага и расплавленным и слегка остуженным агаром. Полученную смесь высевают на чашку Петри с МПА вторым агаровым слоем и после застывания смеси инкубируют в термостате 24 часа. Подсчитать количество «негативных колоний» бактериофага, умножить на степень разведения фага и объем из расчета на 1 мл. Это и будет титр бактериофага по Грациа.

Задание №3. Провести идентификацию холерных бактерий по фаголизабельным свойствам. Для этого выделенную чистую культуру бактерий засевают газоном на чашку Петри с щелочным агаром и закапывают на поверхность посева разные холерные бактериофаги (С4 и Эль-Тор2). Посевы инкубируют в термостате сутки. Учесть результаты посева и сделать заключение.

Задание №4. В отделении возникла вспышка стафилококковой инфекции. При бактериологическом исследовании больных и сотрудников (врач К., санитарка Л., медсестра А.) был высеян гноеродный стафилококк. Провести фаготипирование гноеродного стафилококка с помощью типовых стафилококковых бактериофагов и установить источник инфекции для больных. Результаты зарисовать и ответить на следующие вопросы:

1.Какой применен метод диагностики?

2.Что такое типовые бактериофаги и почему бактериофаг является эпидемиологической меткой?

ЗАНЯТИЕ №14

Тема: Генетика бактерий

Вопросы для подготовки

1.Генетические детерминанты бактерий (нуклеоид, плазмиды, транспозоны, инсерционные последовательности), особенности их строение и функции. Генотип и фенотип бактерий.

2.Классификация видов изменчивости по характеру, диапазону,

33

механизму изменений.

3.Фенотипическая (модификационная) изменчивость, ее суть и особенности.

4.Генотипическая изменчивость, ее суть, отличительные признаки, разновидности.

5.Мутации, их виды. Мутагены, основные группы. Механизм развития мутаций. Репаративные механизмы, их биологическая значимость.

6.Виды генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукция, конъюгация. Их механизмы биологическая значимость.

7.Плазмиды, их характеристика. Основные виды плазмид, характеристика, биологическая значимость.

8.Использование колициногенности бактериальных культур как эпидемиологического маркера для установления идентичности культур различного происхождения.

Задания к практической работе студентов

Задание №1. Учесть результаты готового опыта по индукции мутаций.

Постановка опыта по индукции мутаций у стафилококка с помощью УФЛ как мутагена. На две чашки Петри с питательной средой, в которую добавлен пенициллин, засеяли шпателем 0,1 мл (1 млрд/мл) суспензии стафилококка, чувствительного к пенициллину. Одна чашке оставляется в качестве контроля и подписана «контроль». Вторая подвергается УФ-облучению в течение 4-х секунд и подписана «опыт». Чашки ставят в термостат на сутки.

При учете результатов опыта определить наличие роста в контрольной и опытных чашках, подсчитать число выросших колоний. При оценке опыта ответить на следующие вопросы:

1.Удался ли опыт?

2.Какая мутация получается в опыте, а какая в контроле?

3.Что является мутагеном? Каков его механизм действия?

4.Какой признак микроба подвергся изменению?

5.Что является фактором селекции, обнаруживающим данный мутант?

6.Вычислить частоту спонтанных и индуцированных мутаций? Задание № 2. Учесть результаты опыта по трансдукции. Постановка опыта по трансдукции. Реципиентная культура ки-

шечной палочки, не сбраживающей лактозу (Е.соli lac -), засевается

34

на чашку Петри со средой Эндо-«контроль». Фаголизат (продукт лизиса E.coli lac+ умеренным бактериофагом) смешивают с реципиентом, выдерживают в термостате 15 минут и засевают на среду Эндо – «опыт». Посевы ставят в термостат на сутки.

При учете результатов определяют наличие и характер роста микробов на опытной и контрольной чашках. При оценке опыта ответить письменно на следующие вопросы:

1.Почему в опыте использовалась среда Эндо?

2.Зачем был сделан посев на контрольную чашку, и как нужно оценить характер роста?

3.Как следует назвать всех выросших микробов в опытной чашке?

4.Почему в опытной чашке выросло микробов намного меньше?

5.Отчего в опытной чашке колонии неоднородные? Как это

расценить?

Задание №3. Учесть результаты опыта по трансформации. Постановка опыта по трансформации. Культура стафилококка

ауксотрофного по триптофану, засевается на половину чашки с минимальной по Триптофану средой (контроль). После этого часть данной культуры смешивается с равным количеством раствора ДНК, выделенного из прототрофного по триптофану штамма стафилококка. Смесь выдерживается 20 минут в термостате, после чего делается высев петлей на вторую половину чашки (опыт).

При оценке результатов ответить письменно на следующие вопросы:

1.Удался ли опыт?

2.Отчего нет роста в контрольной чашке и есть в опытной?

3.Какой микроб был донором, какой реципиентом?

4.Какой признак подвергся изменению?

5.Какова характеристика рекомбинанта?

6.Как был обнаружен рекомбинант?

Задание №4. Учесть результаты опыта по конъюгации. Постановка опыта по конъюгации. В пробирке смешивают два

штамма кишечной палочки: №1-E. Coli Hfr Thy- (штамм ауксотрофный по Тимину), №2-E. coli F- T- L- (штамм ауксотрофный по Треонину и Лейцину). После этого производится посев исходных культур №1 и №2, а также смеси на минимальную питательную среду (не содержит Тимина, Лейцина, Треонина). Посев ставится в термостат.

При оценке результатов опыта по конъюгации ответить письменно на следующие вопросы:

1. Удался ли опыт и почему?

35

2.Какой признак микроба подвергся изменению?

3.Отчего нет роста на секторах с посевами культур №1 и№2?

4.Какой микроб был донором, а какой реципиентом?

5.Что передал донор реципиенту?

6.Какова характеристика рекомбинанта и как он был обнаружен? Задание №5. Определить колициночувствительность культур

бактерий, выделенных из разных источников для определения источника инфекции. Для этого колициногенные музейные культуры, выделяющие разные типы колицинов, засеяны уколом в чашки Петри, после чего они убиты хлороформом. Сверху сплошным газоном засеяны исследуемые микробы, выделенные от больных и носителей (каждый на отдельной чашке). Учет производится после суточной инкубации в термостате. При наличии колициночувствительности вокруг колициногенного штамма отмечается стерильная зона. Определить колицинотипы изучаемых культур, обозначив буквами (соответственно типам колицинов, выделяемых набором колициногенных штаммов). Сделать вывод о возможном источнике инфекции.

ЗАНЯТИЕ №15

Тема: Микробный антагонизм. Антибиотики. Принципы рациональной антибиотикотерапии

Вопросы для подготовки

1.Микробный антагонизм, его эволюционная значимость. Практическое использование микробного антагонизма.

2.Понятие «антибиотик», основные источники получения антибиотиков. Природные, полусинтетические и синтетические антибиотики.

3.Требования, предъявляемые к антибиотикам, классификация антибиотиков по происхождению, химическому составу, спектру действия, типу антимикробного действия.

4.Механизмы действия антибиотиков на микроорганизмы.

5.Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам (метод индикаторных дисков, метод серийных разведений).

6.Резистентность и зависимость микробов к антибиотикам, условия формирования, методы выявления.

7.Рациональные пути профилактики формирования резистентных штаммов и преодоления сформировавшейся микробной

36

устойчивости.

8. Осложнения антибиотикотерапии.

Задания к практической работе студентов

Задание №1. Изучить демонстрационный набор препаратов антибиотиков и распределить их в зависимости от происхождения.

Задание №2. Изучить микробный антагонизм в опыте микробная «ловушка» по Перетцу.

В середине чашки Петри с МПА делается посев петлей вульгарного протея, после чего полукругом вокруг посева засевается культура антракоида. Чашки инкубируют в термостате сутки.

Определить наличие антагонизма между протеем и антракоидом по характеру роста протея на питательной среде. Учитывая культуральные особенности этого микроба.

Задание №3. Определить по демонстрационным посевам чувствительность микробов к антибиотикам методом бумажных дисков.

Для этого на плотных питательных средах сплошным газоном произведен посев изучаемой культуры, на поверхность которой наложены диски с антибиотиками. Результаты оцениваются после суточной инкубации в термостате. При наличии антибиотикозависимости вокруг диска отмечается усиленный рост культуры. При антибиотикочувствительности вокруг диска есть зона задержки роста не менее 15 мм в диаметре.

Отметить антибиотикограмму изучаемых культур в протоколе. Задание №4. Определить чувствительность эпидермального ста-

филококка к ампициллину методом серийных разведений.

Были приготовлены серийные разведения антибиотика в пробирках с МПБ. В каждую пробирку внесено определенное количество стафилококка. После суточной инкубации в термостате определять наличие или отсутствие роста бактерий по степени прозрачности бульона. Определить минимально подавляющую концентрацию (МПК) и рассчитать терапевтическую дозу. Данные внести в таблицу:

«+» – рост бактерий, «–« – отсутствие роста

МПК – наименьшая концентрация антибиотика, в присутствии

37

которого угнетается видимый рост микробов. Терапевтическая доза в 2-4 раза выше МПК.

Задание №5. Определение содержания антибиотика в сыворотке крови больного.

Методика: Берется два ряда пробирок. В первом ряду разводится исследуемая сыворотка, к которой добавляют среду с глюкозой и индикатором феноловым красным и стандартизованную взвесь стафилококка в концентрации 1000 м.к./ мл для определения наибольшего разведения сыворотки, задерживающие рост тест-микроба. Во втором ряду готовят разведения стандарта антибиотика (ампициллина), к которому добавляют те же ингредиенты, что и в первый ряд с целью определения наименьшей концентрации антибиотика, дающего отсутствие роста стафилококка.

Для установления концентрации антибиотика в сыворотке больного необходимо умножить полученную МПК ампициллина на наибольшее разведение сыворотки, задерживающее рост тест-микроба.

Задание №6. Учесть чувствительность микроорганизмов к антибиотикам экспресс-методом.

Методика основана на качественной реакции на нитриты. Патологический материал от больного, содержащий возбудителя, выдерживается 1-2 часа в МПБ с добавлением нитрата калия (0,1%), затем он разливается в лунки, в каждую из которых кладут диски с антибиотиками. При росте микробов увеличивается количество дегидраз, образуется нитратредуктаза, которая восстанавливает нитрат калия в нитрит. В лунки добавляют йодистый калий, 5% серную кислоту, 1% р-р крахмала по 0,1 мл каждого компонента. При этом нитраты в присутствии серной кислоты выделяют из йодистого калия йод, который, воздействуя на крахмал, дает синее окрашивание.

ЗАНЯТИЕ №16

Тема: Контрольное занятие по темам № 12-15

Вопросы для подготовки

1.Асептика и антисептика. Стерилизация и дезинфекция. Определение понятий, методы, область применения.

2.Влияние и механизм действия физических факторов на жизнедеятельность бактерий: высокие температуры, высушивание, ультразвук, УФ-лучи, ионизирующее излучение. Прак-

38

тическое применение.

3.Газовая стерилизация, область применения.

4.Механические методы стерилизации, область применения.

5.Стерилизация текучим паром и паром под давлением. Аппаратура, правила работы, механизм действия стерилизующих факторов. Режим стерилизации, область применения. Физический, химический и биологический контроли стерилизации.

6.Пастеризация, тиндализация. Режим работы, область применения.

7.Дезинфектанты, основные группы дезинфектантов, механизм действия, область применения.

8.Антисептики, требования, предъявляемые к ним, основные группы, механизм их действия, область применения, определение чувствительности к ним микробов.

9.Бактериофаги, их природа, строение, формы существования (вегетативный фаг, зрелый фаг, профаг).

10.Классификация фагов по характеру взаимодействия с бактериальной клеткой (умеренные и вирулентные). Лизогения и лизогенная конверсия.

11.Методы культивирования и титрования бактериофагов (по Грациа и Аппельману).

12.Лечебно-профилактическое и диагностическое использование бактериофагов в медицине.

13.Понятие о генотипе и фенотипе. Генетические детерминанты бактерий (нуклеоид, плазмиды, транспозоны, Isпоследовательности), особенности строения, функции.

14.Фенотипическая и генотипическая изменчивости, их суть, отличительные черты.

15.Мутации, их виды. Мутагены, основные группы. Репарации их разновидности, биологическая значимость.

16.Генетические рекомбинации (трансформация, трансдукция, конъюгация), их механизмы, биологическая значимость.

17.Плазмиды, их основные виды, характеристика.

18.Использование колициногенности культур как эпидемиологического маркера для установления идентичности культур различного происхождения.

19.Микробный антагонизм, его эволюционная значимость.

20.Понятие «антибиотик», основные источники получения антибиотиков, природные, полусинтетические и синтетические антибиотики.

39

21.Классификация антибиотиков по химическому составу, механизму действия, спектру действия на микроорганизмы.

22.Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам (метод бумажных дисков, метод серийных разведений). Определение МПК и расчет терапевтической концентрации антибиотика.

23.Резистентность и зависимость микробов к антибиотикам, методы их выявления.

24.Условия селекции устойчивых штаммов и формирования полирезистентных микробных популяций.

25.Рациональная антибиотикотерапия. Осложнения антибиотикотерапии.

ЗАНЯТИЕ № 17

Тема: Итоговое тестирование и сдача практических навыков

Перечень обязательного минимума практических навыков для студентов стоматологического факультета

40