Методичкапо Микробиологии

Справочный материал

Методы выделения чистых культур бактерий. А) Культуральный способ

Этот способ используется для выделения бактерий рода Протеус, которые растут, как правило, на обычных питательных средах сплошной пленкой (ползучий рост). Для выделения чистой культуры протея исследуемый материал засевают по методу Шукевича у основания скошенной части агара в конденсационную воду. Через сутки на всей поверхности скошенной части агара отмечается рост протея, в то время как другие ассоцианты остаются на месте нанесения материала.

Б) Физический способ выделения чистой культуры бактерий Он используется для выделения споровых бактерий. Для этого

смесь бактерий, содержащих споровые микроорганизмы, подвергают кипячению в течение 5 минут для уничтожения неспоровых бактерий. После этого кипяченый материал засевается штрихом в чашки Петри на одну ее половину, а на другую засевается смесью до кипячения.

В) Химический способ выделения бактерий Этот метод используется для выделения кислотоустойчивых

бактерий. Исследуемый материал обрабатывается 5% серной кислотой, все некислотоустойчивые микробы погибают. После этого материал засевают на питательную среду.

Г) Биологический способ выделения чистой культуры Этот способ заключается в том, что исследуемым материалом

заражают лабораторное животное, чувствительное к какому-то микробу, содержащемуся в этом материале. У животных возникает типичный инфекционный процесс с накоплением соответствующего возбудителя во внутренних органах, из которых легко выделяется чистая культура.

ЗАНЯТИЕ № 4

Тема: Бактериологический метод диагностики

Вопросы для подготовки

1.Бактериологический метод диагностики, его этапы, цель.

2.Морфологические, тинкториальные, культуральные, биохи-

11

мические свойства бактерий.

3. Принципы идентификации микроорганизмов.

Задания для самостоятельной работы студентов

Задание №1. Бактериологический метод исследования. Выделить из смеси бактерий чистую культуру бактерий и про-

вести их идентификацию.

Изучаемый объект – смесь бактерий. По готовым демонстрациям провести бактериологическое исследование по дням. Полученные данные занести в таблицу:

1 день исследования – Изучить мазок, приготовленный из смеси бактерий и окрашенный по Граму. При микроскопии мазка установить, какие морфологические виды микробов присутствуют в мазке, определить их тинкториальные свойства. Произвести условный посев смеси штрихом на МПА для получения изолированных колоний.

2 день исследования – В посевах на чашках Петри изучить культуральные свойства бактерий – макроскопические и микроскопические особенности каждой колонии (см. справочные материалы).

Изучить мазок, приготовленный из части изучаемых колоний. Убедиться, что в колонии содержатся одинаковые по морфологии бактерии. Мазки окрашены по Граму.

Из оставшейся части колоний делают посев на скошенный агар для накопления чистой культуры.

3 день исследования – Изучить характер роста бактерий на скошенном агаре. Проверить чистоту культур. Сделать высев с агара на пестрый ряд и в МПБ с целью изучения биохимический свойств бактерий.

4 день исследования –

1. Учесть результаты посевов на средах Гиса и на МПБ:

а) На средах с углеводами отметить наличие кислых продуктов расщепления углеводов и газообразование.

б) На МПБ обратить внимание на характер роста, отметить наличие продуктов гидролиза белка (сероводорода и индола).

12

2.Провести идентификацию чистых культур бактерий: проанализировать все полученные свойства микробов (морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические) и установить видовую принадлежность выделенных бактерий.

Справочный материал

Макроскопические признаки колоний:

Впроходящем свете:

1.величина колоний (мелкие, средние, крупные);

2.форма колоний (круглая, неправильная);

3.прозрачность (прозрачная, просвечивающая, непрозрачная).

Вотраженном свете:

1.высота колонии (плоская, плосковыпуклая, куполообразная);

2.поверхность колоний (гладкая, блестящая, шероховатая, матовая);

3.цвет колоний (бесцветная, пигментная, цвет пигмента).

Микроскопические признаки колоний Изучаются под микроскопом с увеличением объектива х 8, со

слегка опущенным конденсором. Эмульгируемость колоний в физиологическом растворе (хорошо или плохо эмульгируется) проверяется при приготовлении из колоний мазков с целью микроскопии их.

1.край колонии (правильно закругленный, волнистый, фестончатый, зубчатый, бахромчатый, петлеобразный);

2.структура колоний (гомогенная, негомогенная, аморфная, зернистая);

3.консистенция колоний (мягкая, слизистая, хрупкая).

ЗАНЯТИЕ №5

Контрольное занятие по разделу: «Морфология и физиология микроорганизмов»

Вопросы для подготовки

1.Бактерии – общая характеристика, положение в системе микроорганизмов. Основные принципы классификации микроорганизмов.

2.Иммерсионный микроскоп, разрешающая способность, техника микроскопии. Иммерсионное масло, значение для микроскопии.

13

3.Техника приготовления мазка из культур бактерий.

4.Простые и сложные методы окраски бактерий, их информативность, область применения.

5.Негативные способы окраски бактерий, область применения.

6.Окраска бактерий по Грамму, химизм окраски.

7.Микроскопический метод диагностики инфекций, его достоинства и недостатки. Морфологические и тинкториальные свойства бактерий.

8.Сравнительная характеристика прокариотной и эукариотной клетки.

9.Клеточная стенка грамотрицательных и грамположительных бактерий, особенности строения, функции. Медицинские препараты, изготавливаемые из клеточных стенок микроорганизмов, их свойства, применение.

10.Основные формы бактерий – кокки, палочковидные и извитые, их морфологические и тинкториальные свойства.

11.Кислотоустойчивые бактерии, особенности химического состава, методы окраски.

12.Ядро бактерий, строение, функции, способы выявления.

13.Цитоплазматическая мембрана, строение и функции.

14.Цитоплазма бактерий, цитоплазматические включения, их роль в жизнедеятельности бактерий, методы выявления зерен волютина.

15.Капсула бактерий, строение, функции, методы выявления.

16.Прото-, сферопласты и L-формы бактерий, их биологические особенности.

17.Бактериальные мезосомы, рибосомы, их строение и функции. Значимость сравнительного изучения рибосом бактерий и клеток человека.

18.Жгутики и реснички, строение, значение, методы выявления у бактерий.

19.Ворсинки бактерий, их виды, роль в жизнедеятельности, факторы адгезии.

20.Споры бактерий, строение, химический состав. Бациллы и клостридии, методы выявления.

21.Принцип люминесцентной, фазово-контрастной, темнопольной и электронной микроскопии, область применения. Достоинства и недостатки разных видов микроскопий.

22.Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний, его достоинства и недостатки.

14

23.Морфология хламидий, особенности их культивирования.

24.Особенности морфологии и химического состава риккетсий, методы культивирования.

25.Строение спирохет, методы выявления.

26.Классификация микроорганизмов по типам питания (аутотрофы, гетеротрофы, фототрофы, хемотрофы). Прототрофность и ауксотрофность у бактерий.

27.Основные механизмы питания бактерий (пассивное и активное проникновение питательных веществ).

28.Основные питательные среды для выращивания бактерий, этапы приготовления МПА и МПБ, требования, предъявляемые к питательным средам.

29.Классификация питательных сред по составу, консистенции, назначению и источнику получения.

30.Фазы размножения бактериальной популяции в жидкой питательной, замкнутой среде. Влияние проточного культивирования и аэрации на фазы размножения, область применения.

31.Методы выделения чистых культур аэробных бактерий.

32.Бактериологический метод диагностики инфекций, его цель, этапы. Принципы идентификации бактерий.

33.Культуральные свойства бактерий, их изучение, значение.

34.Пигменты бактерий, их виды, классификация по химическому составу, роль в жизнедеятельности бактерий.

35.Классификация бактерий по типам дыхания (аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы, микроаэрофилы). Сущность аэробного и анаэробного дыхания. Способы брожения.

36.Способы культивирования анаэробов. Питательные среды.

37.Ферменты бактерий, их классификация по механизму действия, химическому составу. Конститутивные и адаптивные ферменты.

38.Сахаролитические и протеолитические свойства бактерий, методы и цель их изучения.

39.Понятия чистая культура, колония, клон, штамм бактерий.

40.Культуральный, химический, физический и биологический методы выделения чистых культур бактерий.

41.Общая характеристика грибов, классификация их, методы выявления. Морфология плесневых грибов рода Mucor, Aspergillus, Penicillium.

42.Особенности строения микоплазм, культивирование, роль в патологии человека.

15

ЗАНЯТИЕ № 6

Тема: Инфекция, инфекционный процесс, инфекционная болезнь. Патогенность и вирулентность микроорганизмов

Вопросы для подготовки

1.Инфекция, инфекционный процесс, инфекционная болезнь.

2.Виды симбиоза между микробами и макроорганизмом (мутуализм, комменсализм, паразитизм). Паразиты факультативные и облигатные. Условно-патогенные микроорганизмы, их роль в патологии человека.

3.Факторы, определяющие течение инфекционного процесса (свойства микроба, состояние макроорганизма, условия внешней среды).

4.Патогенность и вирулентность микроорганизмов – определения, критерия патогенности (инфективность, инвазивность, токсигенность). Единицы измерения вирулентности.

5.Факторы инвазии бактерий: капсула, адгезины, ферменты инвазии, их характеристика и значение в инфекционном процессе.

6.Токсины бактерий: экзо- и эндотоксины, их сравнительная характеристика.

7.Тропизм микробов к определенным клеткам и тканям. Виды адгезинов у грамположительных и грамотрицательных бактерий.

8.Стадии инфекционной болезни (инкубация, продрома, стадия выраженных клинических проявлений, исход болезни).

9.Пути передачи возбудителей и распространения их по организму.

10.Формы инфекционных болезней по их распространению в человеческой популяции (спорадические заболевания, эпидемии, пандемии), по остроте процесса (острая, подострая, хроническая), по распространению в организме (локальная и генерализованная). Персистенция микроорганизма.

11.Формы инфекционного процесса по происхождению (экзогенная, эндогенная), по числу инфекционных агентов (моно- и микст-инфекция), по характеру встреч с возбудителем (первичная, вторичная, рецидив, реинфекция, суперинфекция).

12.Бактерионосительство, его характеристика (транзиторное, постоянное, «злостное») Причины микробного носительства.

16

Задания для самостоятельной работы студентов

Задание №1. Действие бактериальных токсинов на макроорганизм.

На белых мышах воспроизводят эндотоксиновый шок. Для этого взвесь в физиологическом растворе суточной культуры протея вводят внутрибрюшинно белой мыши. Вторую мышь оставляют незараженной для контроля. В течение всего занятия ведут наблюдение за развитием симптомов эндотоксиновой интоксикации. Объяснить механизм освобождения токсина, его действие на организм. Можно ли назвать данный инфекционный процесс инфекционной болезнью?

Задание №2. Промикроскопировать мазки-отпечатки, приготовленные из внутренних органов мыши, погибшей спустя 24 часа после заражения внутрибрюшинно взвесью капсульной палочки (грамотрицательные бактерии). При микроскопии отметить наличие микробов, их морфологию, количество, наличие у него капсулы. Сделать вывод о форме инфекционного процесса (токсинемия или сепсис).

Задание №3. Определить факторы инвазии и патогенности 3-х штаммов стафилококков:

а) на цитратной плазме изучить характер роста стафилококков

– отсутствие или наличие свертывания плазмы (плазмокоагулазную активность);

б) определить гиалуронидазную активность стафилококков (учесть готовую реакцию).

Схема постановки опыта

Готовую взвесь исследуемой культуры бактерий на дистиллированной воде разливают в ряд пробирок с 0,5 до 0,1. В каждую пробирку с разведенной культурой добавляют одинаковое количество гиалуроновой кислоты. После инкубации в термостате – 15 минут и 5 минут на холоде добавляют уксусной кислоты.

Если исследуемая культура не обладает гиалуронидазной активностью, то при добавлении уксусной кислоты наблюдается коагуляция гиалуроновой кислоты и выпадение ее в осадок в виде сгустка муцина.

При наличии гиалуронидазной активности и достаточной концентрации фермента происходит расщепление гиалуроновой кислоты, что не ведет к образованию сгустка. Титром гиалуронидазы считается то наименьшее количество взвеси бактерий, которое еще препятствует появлению сгустка муцина под действием уксусной кислоты.

в) на кровяном агаре отметить наличие или отсутствие зон ге-

17

молиза вокруг колоний стафилококков (зона просветления агара вокруг колоний);

г) на желточно-солевом агаре отметить наличие или отсутствие вокруг посева культур зоны просветления или помутнения среды (расщепление или преципитация лецитина), по наличию которых делается вывод о лецитиназной активности микробов. Полученные данные по изучению факторов патогенности 3-х штаммов стафилококков внести в таблицу:

N культуры Гемолиз Плазмокоагулаза Лецитиназа Гиалуронидаза

1

2

3

Сделать вывод о выраженности патогенных свойств у исследуемых культур.

ЗАНЯТИЕ № 7

Тема: Неспецифическая резистентность организма

Вопросы для подготовки

1.Понятие неспецифической резистентности.

2.Классификация факторов неспецифической резистентности:

1.Клеточные и тканевые факторы; 2. гуморальные факторы.

3.Клеточные и тканевые факторы неспецифической резистентности:

– лихорадочная реакция;

– ареактивность клеток и тканей;

–барьерная функция кожных покровов и слизистых;

–барьерная функция лимфоидной ткани;

–барьерные свойства кислоты желудочного сока;

–воспаление;

–выделительная функция органов;

–нормальная микрофлора;

–фагоцитоз (виды фагоцитирующих клеток, стадии фагоцитоза);

–естественные киллеры;

–общий адаптационный синдром.

18

4.Гуморальные факторы неспецифической резистентности:

–система комплемента, его строение, функции, пути активации, функции;

–лизоцим;

–бета-лизины;

–трансферрин, лактоферрин;

–противовирусные ингибиторы;

–интерфероны, механизмы и спектр действия;

–нормальные антитела;

–цитокины.

5.Гуморальные и клеточные факторы неспецифической резистентности, действующие в полости рта: лизоцим, лактопероксидаза, сиалин, компоненты системы комплемента, лактоферрин; защитные свойства слизистой полости рта, фагоцитирующие клетки, буферные системы слюны.

Задания к практической работе студентов

Задание№1. Определить лизоцим в слюне качественным методом.

Для обнаружения лизоцима к расплавленному и остуженному агару добавляют густую взвесь суточной культуры Micrococcus lyzodeikticus в физиологическом растворе, перемешивают и пастеровской пипеткой готовят агаровые пластины на предметных стеклах. На застывшие пластины наносят каплю слюны и оставляют на 10-20 минут. Затем промывают пластины водой и рассматривают в проходящем свете. При наличии лизоцима в слюне на месте ее нанесения наблюдается просветление агара, вследствие растворения микрококка.

Задание№2. Определить лизоцимную активность куриного белка. Для этого готовят десятикратные разведения белка физиологическим раствором и к каждому разведению добавляют 2-х млрд. взвесь микрококка по 2 капли. Ставят в термостат на 20 минут. Результат учитывают по наличию просветления в среде (полный лизис микрококка). Учесть полученные результаты и данные занести в таб-

лицу. Определить титр лизоцима.

Титр лизоцима – то наибольшее разведения белка, при котором еще происходит полный лизис микрококка.

Задание№3. Определить титр комплемента в сыворотках морской свинки и человека по реакции иммунного гемолиза.

Для этого сыворотки разводят с 0,5 до 0,1 мл в физиологическом

19

растворе. К каждому разведению сыворотки добавляют 3% взвесь эритроцитов барана и инактивированную гемолитическую сыворотку. Пробирки ставят в термостат на инкубацию. Учет производят по наличию полного гемолиза. Сыворотка человека используется неразведенная, а сыворотка морской свинки предварительно разводится в

10 раз.

Титром комплемента называется его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз.

Учесть результаты реакций, определить титры комплемента в сыворотке человека и морской свинки, сделать заключение. Полученные данные занести в таблицу.

Задание№4. Определить фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови.

Готовые окрашенные мазки микроскопируют с иммерсией. В разных полях зрения находят не менее 25 лейкоцитов и считают количество микробов, поглощенное каждым лейкоцитом. Для характеристики фагоцитарной активности крови подсчитывают фагоцитарное число и фагоцитарный показатель.

Фагоцитарный показатель – процент активно фагоцитирующих лейкоцитов в расчете на 100 лейкоцитов.

Фагоцитарное число – среднее количество микробов, поглощенных одним фагоцитом (для этого общее число поглощенных микробов делят на количество подсчитанных клеток-25).

Сделать заключение о проделанной работе.

ЗАНЯТИЕ №8

Тема: Приобретенный иммунитет. Антигены, антитела. Гуморальный иммунный ответ. Реакция агглютинации, ее варианты. Серологический метод диагностики

Вопросы для подготовки

1.Классификация видов и форм иммунитета

2.Врожденный видовой иммунитет, его механизм.

3.Приобретенный иммунитет, его разновидности, характеристика приобретенного иммунитета.

4.Понятие об антигене, свойства антигенов, классификация антигенов. Гаптены, полугаптены.

20