1.Определение коллагена в мясе по методу в.П. Воловинской

Порядок проведения анализа. Измельченный образец ткани массой 10 г растирают с 50 см раствора хлорида натрия массовой долей 0,6%. Полученную смесь переносят в центрифужную пробирку, ополаскивая ступку и пестик 50 см того же раствора. Смесь экстрагируют в течение 1 ч, затем центрифугируют в течение 15 мин при частоте вращения 33-50 с. Жидкую фракцию удаляют, а к осадку прибавляют 100 см раствора гидроксида натрия массовой долей 0,2%. Через 12-14 ч после тщательного перемешивания жидкую фракцию определяют центрифугированием. Остаток ткани обрабатывают щелочью ещё 2 раза, каждый раз добавляя по 50 см раствора гидроксида натрия массовой долей 0,2%.

Остаток ткани из пробирки количественно переносят в стакан, смывая раствором гидроксида натрия массовой долей 0,1% (объем раствора гидроксида натрия 100 см). Содержимое стакана нагревают при умеренном кипении в течение 30 мин, по возможности сохраняя объем жидкости в стакане периодическим добавлением горячей воды. Затем частицам ткани дают возможность осесть на дне стакана и в горячем виде жидкость осторожно декантируют с осадка в мерную колбу вместимостью 200 см через воронку с небольшим количеством ваты, предварительно проверенной на содержание азота.

Остаток в стакане вместе с ватой, через которую проводилось фильтрование, при кипении обрабатывают водой, для чего в стакан наливают 100 см горячей дистиллированной воды и при умеренном кипении раствор сгущают за 1,5-2,0 ч до 1/3 первоначального объема. Сгущенный раствор через 15-20 мин декантируют с осадка через вату в ту же мерную колбу вместимостью 200 см.

Аналогично при кипении остатки ткани обрабатывают водой еще два раза. После последней экстракции вату промывают водой и промывные воды присоединяют к общему объему экстракта.

Собранный в мерную колбу экстракт подкисляют раствором уксусной кислоты массовой долей 20% до рН 4,8, нагревают до 50⁰С и после охлаждения доводят водой до метки. При подкислении выпадает небольшое количество белков, от которых освобождаются фильтрованием через бумажный фильтр. Из фильтра берут 20 см и после минерализации определяют азот.

Массовую долю азота в коллагене (%) вычисляют по формуле

N=(a200100)/(20m),

где а – массовая доля азота в 20 см фильтрата,%; m – масса навески ткани, г.

Коэффициент пересчета азота на коллаген равен 5,62.

2. Определение коллагена на основе предварительного гидролиза

Порядок проведения анализа. Навеску мяса массой 4 г вносят в колбу Кьельдаля вместимостью примерно 100 см со шлифом для присоединения обратного холодильника. К навеске добавляют 7 см воды, 10 см соляной кислоты молярной концентрацией 12 моль/дм и 0,7 г хлорида олова (II).

К колбе присоединяют пришлифованный шариковый холодильник и включают воду. Нагревание ведут на воздушной или песчаной бане. Для воздушной бани удобно использовать колбонагреватель(электроплитку с коническим углублением). С момента закипания жидкость нагревают ровно 7 ч, после чего плитку выключают и отстаивают от колбы. Еще теплую колбу отсоединяют от холодильника и содержимое переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см. Исходную колбу несколько раз ополаскивают водой (общий объем промывных вод должен быть не более 2/3 объема колбы).

Для ускорения процесса гидролиз проводят в автоклаве. Навеску мяса массой 4 г вносят в ампулу вместимостью 25 см через расширенную часть горлышка (обрезают запаянный конец пустой ампулы так, чтобы образовалась воронка). К навеске добавляют 7 см воды, 10 смконцентрированной соляной кислоты и 0,7 г хлорида олова (II). Ампулы запаивают на горелке и помещают в автоклав температурой 112-114⁰С на 3,5 ч, после чего их можно хранить длительное время.

Содержание ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, остатки смывают дистиллированной водой (общий объем промывных вод должен быть не более 2/3 объема колбы).

Содержимое мерной колбы независимо от способа гидролиза нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 6 моль/дм, а затем доводят насыщенным раствором карбоната натрия до рН 8,0-8,2. После образования белого осадка начинают контролировать рН, используя рН-метр со стеклянным электродом или универсальный индикатор и фенолфталеин.

При работе по последнему способу из колбы отбирают тонкой стеклянной палочкой одну каплю жидкости и помещают ее на пластинку из молочно-белого стекла. Добавляют несколько капель дистиллированной воды и одну каплю универсального индикатора. После того как по универсальному индикатору рН жидкости будет близок к 7,5, добавляют несколько кубических сантиметров раствора карбоната натрия. Обработка считается законченной, если капля раствора, смешанная с водой, окрасится в чуть заметный розовый цвет (по фенолфталеину).

Колбу с жидкостью быстро охлаждают, объем доводят до метки дистиллированной водой и оставляют в покое в течение 30 мин. Затем осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера при слабом разрежении.

Если фильтр мутный, его вторично фильтруют через тот же самый фильтр. Фильтрат светло-желтого цвета должен быть совершенно прозрачным. Одновременно гидролизуют, а затем нейтрализуют и фильтруют несколько проб.

В пробирки отмеряют пипетками по 1 см растворов в указанном порядке: исследуемый фильтрат, раствор сульфата меди молярной концентрацией 0,01 моль/дм, раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм, раствор пероксида водорода массовой долей 6%. Одновременно проводят три контрольных опыта, в которых исследуемый фильтрат заменяют 1 см дистиллированной воды.

Растворы в пробирках перемешивают, периодически встряхивая, в течение 5 мин. Затем пробирки помещают на водяную баню при 80⁰С на 5 мин, часто и энергично встряхивая их. При этом пробирки должны быть глубоко погружены в воду. По окончании нагревания пробирки охлаждают на водяной бане со льдом и добавляют в каждую при перемешивании 4 см раствора серной кислоты молярной концентрацией 3 моль/дм, а затем при сильном перемешивании 2 см раствора пара-диметиламинобензальдегида.

Далее пробирки помещают на водяную баню при 70⁰С на 16 мин, после чего охлаждают водопроводной водой (под краном) и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 560 нм или фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Измерения сравнивают с контрольным опытом. Предварительно измеряют оптическую плотность двух контрольных растворов (одного относительно другого). Третий контрольный раствор служит запасным, его используют только в случае расхождения в показаниях первых двух растворов.

Построение калибровочного графика. Растворы оксипролина концентрацией 0,5-25,0 мкг/см подвергают всем операциям согласно описанию метода, начиная с гидролиза, так как в процессе последнего некоторое количество оксипролина разрушается.

Калибровочный график для определения оксипролина:

1 – без гидролиза; 2 – после кислотного гидролиза

По калибровочному графику находят концентрацию оксипролина в объеме жидкости, находящейся в пробирке после добавления пара-диметиламинобензальдегида (10 см).

Массовую долю оксипролина в ииследуемом образце (мг%) расчитывают по формуле:

,

где с – концентрация оксипролина в 10 см окрашенного раствора, определенная по калибровочному графику, мг; 100 – объем раствора, полученный после нейтрализации, см; 100 – множитель для перевода в проценты; V – объем раствора, взятый для цветной реакции, см; m – масса навески мяса, г.

Предварительно из величины оптической плотности, отнесенной к 1 см гидролизата, соответствующего 40 мг мяса, вычитают поправку, равную 0,082 единицы оптической плотности.

Количество оксипролина пересчитывают на белки соединительной ткани, умножая на коэффициент 8,07.

При содержании оксипролина до 25 мкг в 10 см окрашенного раствора в исследуемом образце можно работать без калибровочного графика, пользуясь следующей формулой:

,

Где D – оптическая плотность; 0,01 – количество оксипролина, соответствующее 0,164 оптической плотности; 100 – объем раствора после нейтрализации; 100 – множитель для перевода в проценты; 0,164 – величина оптической плотности, полученная для чистого оксипролина; V – объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см; m – масса навески мяса, г.

Величина оптической плотности до 0,3-0,4 единицы пропорциональна концентрации оксипролина.

Для пересчета содержания соединительнотканных белков в массовые доли от общего содержания белков используют уравнение:

,

Где 8,07 – коэффициент пересчета оксипролина на белки соединительной ткани; х – массовая доля оксипролина,%; 6,25 – коэффициент пересчета на белки; N – массовая доля общего азота в мясе, %.

Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:

Образец или вид ткани	Массовая доля,%
	азота	коллагена

По результатам экспериментальных исследований формулируют выводы и делают общее заключение по работе. При этом рекомендуется сравнить полученные данные с литературными, а также указать преимущества и недостатки используемых подходов в анализе коллагена.

Список литературы

1. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясных продуктов. – М.:КолосС, 2004. – 571 с.: ил. – (Учебники и учеб. Пособия для студентов высш. Учеб. Заведений). – с.73-80