МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Учреждение образования «Гродненский государственный аграрный университет»

Кафедра переработки и хранения животного сырья

Лабораторная работа

«Определение коллагена в мясе»

Выполнила студентка

3 курса 4 группы ИТФ

Пастырчук Дарья Дмитриевна

Гродно, 2012

Цель работы. Приобрести навык в определении количественного содержания коллагеновых белков в образцах различных видов тканей убойных животных и птицы.

Задачи. Экстрагировать коллаген и количественно определить его на основе минерализации, а также путем гидролиза коллагеновых полипептидов с последующим проведением качественной реакции на оксипролин и фотометрированием.

Объекты исследования. Образцы мышечной и соединительной ткани убойных животных и птицы.

Методические указания. Количественное определение коллагена в животных тканях проводят либо по методу В. П. Воловинской, основанному на экстрагировании фракции коллагеновых белков и последующем определении в экстрактах белкового азота, либо по количественному содержанию аминокислоты оксипролина, специфической для коллагена. Метод основан на предварительном гидролизе коллагеновых полипептидов с последующим проведением качественной цветной реакции на оксипролин и фотометрированием. Включает следующие основные операции:

- гидролиз ткани соляной кислотой в присутствии хлорида олова;

- нейтрализация кислоты и удаления олова;

- окисление оксипролина;

- развитие цветной реакции с пара-диметиламинобензальдегидом;

- измерение интенсивности окраски фотометрированием.

Результаты, полученные по этому методу, приведены в таблице.

Таблица. Массовая доля(%) оксипролина и соединительнотканных белков в разных видах тканей

Образец	Оксипролин	Соединительнотканные белки
Поясничная мышца свиней	0, 046	0,371
Шейная часть туши крупного рогатого скота	0, 322	2,600
Филей крупного рогатого скота	0,220	1,800
Сырые связки убойных животных	10,56	85,200

Расчет количества белка ведут на основании известного массового содержания оксипролина (23% к сумме аминокислот) в коллагенах.

Для выделения оксипролина мышечную ткань подвергают гидролизу с применением кислоты или щелочи. Продолжительность гидролиза имеет большое значение: недостаточная приводит к неполному освобождению оксипролина, а избыточная – к частичному его разрушению.

Добавление хлорида олова II (не менее ¾ количества белка в навеске) необходимо для предотвращения образования гуминовых веществ.

При нейтрализации и подщелачивании гидролизата используют карбонат натрия, чтобы предотвратить образование ионов олова в щелочной среде и облегчить его удаление в виде гидрата олова.

Окисление оксипролина пероксидом водорода в щелочной среде приводит к образованию продуктов, дающих с пара-диметиламинобензальдегидом цветную реакцию. Следы пероксида водорода могут понизить интенсивность окраски или придать раствору неспецифический оттенок, поэтому его избыток разрушают нагреванием на водяной бане при 80⁰С. При этом рекомендуется добавлять мочевину, образующую довольно стойкое соединение с пероксидом водорода CO(NH2)2 H2O2.

Интенсивность образовавшейся розовой окраски измеряют спектрофотометрически или колориметрически. Окраска устойчива в течение 60-90 мин. В пределах до 25 мкг оксипролина поглощение подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. Специфичность реакции очень высока.

Из всех аминокислот, содержащихся в кислотном гидролизате белков мяса, определению мешает только тирозин. По данным Е. Вербицкого и Ф. Е. Деасраджа, окраска тирозина составляет 1,3% окраски, развиваемой оксипролином. Поэтому используется поправка на тирозин – 0,072 единицы оптической плотности на 1 см кислотного гидролизата, соответствующего 40 мг мяса:

Полная поправка с учетом окраски самого гидролизата, соответствующей 0,01±0,003, составляет 0,082 единицы оптической плотности на 40 мг мяса в 1 см гидролизата.

Для проведения цветной реакции в зависимости от ожидаемого содержания соединительной ткани в продукте следует брать разные объемы испытуемого раствора. Если, например, на анализ взята препарированная длиннейшая спинная мышца свиньи, то объем исследуемого раствора может быть равен 1 см(при разведении гидролизата до 100см). Массовая доля соединительной ткани в указанной мышце составляет 0,2-0,4%. Если же взят образец, содержащей больше соединительной ткани, то на цветную реакцию нужно значительно меньше испытуемого раствора. Объем раствора доводят до 1 см дистиллированной водой.

Подготовка проб к анализу. Ткани животных предварительно режут на маленькие кусочки и взвешивают согласно нижеприведенным рекомендациям в соответствии с принятым методом определения.