- •Вопросы и ответы
- •1. Характеристика бактериоскопического метода исследования.
- •2. Световые микроскопы. Принципы устройства простого, фазовоконтрастного, темнопольного, люминесцентного микроскопов и их применение в микробиологии. Техника иммерсионной микроскопии.
- •3. Типы микроскопических препаратов. Этапы приготовления фиксированного мазка. Простые методы окраски.
- •4. Дифференциально-диагностические методы окраски микробов. Окраска по Граму, механизм и техника окраски.
- •5. Морфология бактерий. Отличия прокариотов от эукариотов. Основные формы бактерий.
- •6. Структура и функции поверхностных образований бактериальной клетки. Капсула. Методы выявления.
- •7. Структура и функции клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Формы бактерий с дефектами клеточной стенки.
- •8. Цитоппазматические структуры бактерий, функции, методы выявления. Кислотоустойчивые микробы. Метод окраски.
- •9. Покоящиеся формы микробов. Спорообразование у бактерий, стадии, методы выявления спор.
- •10. Подвижность бактерий, методы выявления подвижности.
- •11. Принципы систематики микробов. Систематическое положение микробов. Таксономические категории. Понятие и критерии вида.
- •12-16. Систематическое положение и морфология спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, хламидий. Методы изучения.
- •17. Питание микробов. Источники углерода, азота, ростовых факторов и зольных элементов. Способы питания. Способы проникновения питательных веществ в клетку через мембрану.
- •18. Дыхательный аппарат бактерий. Пути биологического окисления. Классификация микробов по этому признаку
- •19 Способы размножения микробов. Механизм и фазы клеточного деления.
- •20. Характеристика бактериологического метода исследования
- •21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным средам, классификация.
- •22. Методы выделения чистых культур аэробов.
- •23. Методы выделения чистых культур анаэробов.
- •24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологическая, генетическая.
- •26. Генетический аппарат бактерий (хромосомы, плазмиды) характеристика бактериальных транспозонов. Биологическая роль плазмид.
- •27. Виды изменчивости бактерий. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Понятие о популяционной изменчивости.
- •28. Мутационная изменчивость. Генетические рекомбинации. Практическое значение изменчивости микроорганизмов. Понятие о генной инженерии и биотехнилогии.
- •29. Молекулярная диагностика. Цель. Задачи. Методы.
- •30. Молекулярная гибридизация. Полимеразная цепная реакция.
- •31. Учение об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса. Отличительные признаки инфекционных заболеваний. Типы инфекций.
- •32. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность Факторы патогенности.
- •33. Роль макроорганизма, физической и социальной среды в инфекционном процессе.
- •34. Биологический метод исследования задачи, оценка этапы.
- •35. Химиотерапия и химиопрофилактика. Антибиотики определение классификация.
- •36. Механизм действия антибиотиков.
- •37. Побочное действие антибиотиков.
- •38. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам.
- •39 Методы изучения чувствительности микробов к антибиотикам.
- •40. Экология микроорганизмов. Типы экологических связей.
- •41. Характеристика нормальной микрофлоры человека и ей биологическая роль. Методы изучения. Гнотобиология. Дисбактериоз. Причины развития, принципы коррекции.
- •42 Стерилизация, дезинфекция. Определение понятий, методы проведения.
- •43. Асептика, антисептика. Определение понятий. Способы проведения.
22. Методы выделения чистых культур аэробов.
Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18—24 ч.
Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.
Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.
23. Методы выделения чистых культур анаэробов.
Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребностям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адекватно редуцированными
Посевы с целью выделения анаэробной микрофлоры, как спо-рообразующей (клостридии), так и неспорообразующей (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных условиях. Первичные посевы делают на обогатительные среды (тиогликолевую, Китта — Тароцци), затем пересевают на плотные среды: сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высокий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта — Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.
При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (клостридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных клеток посторонней микрофлоры, которая может присутствовать в исследуемом материале
24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологическая, генетическая.
???
Идентификация – это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.
25. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов.
Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных
продуктов.
Карбогидразы- ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:
а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;
б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);
в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).
Протеазы-ферменты, разлагающие белки:
а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);
б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты;
в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;
г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;
д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.
Ферменты-токсины: Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.
Цитотоксины- ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.
Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.
Ппазмокоагулаза- фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа - см. выше.
Оксидо-редуктазы:
1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).
2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.
3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.
4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК),Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода. Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии.
В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:
Колонии ---- Приготовление ---- Внесение ----- Инкубация ---- Учет(+ -) ---- Интер-
суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду
В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде "+" или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной
микроорганизм.