Галицкий ЭА_Радиобиология_2001

вод, что наследственная информация клетки локализована в ядре, а не в цитоплазме.

В 1884 г. было обнаружено, что хроматин ядра состоит из определенного числа нитевидных частиц (хромосом) и что ядра яйцеклетки и сперматозоида дают в оплодотворенное яйцо равное число хромосом. Уже в 30-е г. прошлого века, когда формировалось понятие о клетке как о фундаментальной единице живого, в исследованиях по химии питания было выявлено, что в состав живого вещества входят липиды, углеводы и белки. Липиды характеризуются тем, что очень слабо растворимы в воде, но обычно хорошо растворимы в органических растворителях, например, в хлороформе или этаноле. Типичный липид состоит из молекулы глицерина, три гидроксильные группы которого соединены эфирными связями с жирными кислотами. Жирные кислоты представляют собой длинные цепи атомов углерода (от 3 до 27) с гидроксильной группой на конце. Именно длинные цепи жирных кислот обусловливают нерастворимость липидов в воде.

Углеводы — это соединения, в которых атомы углерода, водорода и кислорода находятся в соотношении 1:2:1 и имеют общую эмпирическую формулу CnH2nOn. Большую часть углеводов клетки составляют полисахариды, представляющие собой длинные цепи, построенные из сотен связанных друг с другом молекул. Например, крахмал и целлюлоза — это длинные цепи связанных друг с другом молекул глюкозы.

Белки — азотистые соединения, в естественном состоянии обычно растворимые в воде. На их долю приходится от половины до двух третей сухой массы большинства клеток («сухая масса» — это масса клетки после удаления содержащейся в ней воды; вода составляет около 80% полной массы большинства клеток). Одним из первых, кто исследовал белки, был Г.Мюльдер, назвавший их в 1838 г. «протеинами» (от греч. протеос — важнейший, первичный). Позднее он писал: «Как в растениях, так и в животных содержится вещество, которое... и в тех и в других осуществляет важную функцию. Это одно из очень сложных веществ, способное изменять свой

41

состав в зависимости от условий и служащее... для регуляции химического метаболизма... Без сомнения, это наиболее существенный из известных компонентов живой материи и, повидимому, жизнь без него была бы невозможна».

К концу XIX в. были открыты 16 аминокислот из тех 20, которые входят в состав белков, а последняя из известных ныне аминокислот — треонин — была идентифицирована лишь в 1935 г.

Как аминокислоты соединены между собой в белковой молекуле, впервые описал Э.Фишер в 1902 г. Он предположил, что в белках аминогруппа одной аминокислоты связана с карбоксильной группой соседней аминокислоты с помощью амидной связи, образование которой сопровождается отщеплением молекулы воды. Амидная связь, соединяющая таким образом две аминокислоты, называется пептидной связью, а соединенные пептидной связью аминокислоты — пептидами. Таким образом, белковая молекула представляет собой полипептидную цепь, состоящую из многих аминокислотных остатков, в которой каждый остаток соединен с соседним остатком пептидной связью.

В течение первых трех десятилетий XX в. было выяснено два существенных факта: во-первых, то, что каждый белок состоит из полипептидной цепи определенной длины, при- чем у разных белков длина цепи различна и составляет от нескольких десятков до нескольких сотен аминокислотных остатков; во-вторых, то, что в каждом белке содержатся характерные для него относительные количества известных двадцати аминокислот. Эти факты позволили сделать вывод: индивидуальная особенность каждого типа белка зависит от того, сколько аминокислот и какие именно составляют его полипептидную цепь.

При поглощении высоких доз радиации клетка под микроскопом выглядит в общих чертах так же, как и после воздействия высокой температуры или сильного яда. Нарушается целостность и гладкость ее оболочки (плазматической мембраны), мембран ядра и других клеточных органелл, ядро уплотняется, разрывается или, наоборот, разжижается. После

42

поглощения меньших доз радиации, когда клетка остается еще живой, в ее органеллах происходят более или менее существенные изменения, особенно в клеточном ядре.

Сначала рассмотрим действие радиации на белки. Особенности того или иного белка определяются последовательностью и природой аминокислот в цепи (первичная структура) и сложной конфигурацией цепей аминокислот (вторич- ная и третичная структуры). Одни белки выполняют роль структурных компонентов клетки, другие (ферменты) — органических катализаторов клеточных биохимических реакций. Радиобиологи исследуют как физико-химическое, так и биологическое действие ионизирующих излучений на ферменты. К физико-химическим критериям повреждения относятся: уменьшение молекулярной массы вследствие разрыва полипептидных цепей (цепей аминокислот), изменение растворимости, нарушение вторичной и третичной структур, образование сшивок и агрегатов (соединений друг с другом различ- ных частей белков), а также разрушение аминокислот в цепи. Биохимическим критерием повреждения является потеря ферментами способности осуществлять свои реакции. Для повреждения известных ферментов требуется облучение гораздо в более высоких дозах, чем для возникновения серьезных изменений в клетке, приводящих ее к гибели. Этот факт объясняют малой чувствительностью биохимических методов или тем, что в клетке есть более чувствительные к облучению мишени, чем ферменты.

Наиболее опасны повреждения ядра, так как именно ядро несет наследственную информацию о самой клетке, всем организме и даже биологическом виде. Ядро передает эту информацию от клетки к клетке, от организма к организму. Наследственная информация хранится в специальных структурах, напоминающих по виду под микроскопом палочки, которые отчетливо видны при делении клетки благодаря способности хорошо накапливать специальные красители. Данному свойству они и обязаны своим названием — хромосомы, (хромосома — по-греч. «окрашенная» клетка, тельце). Вещество хромосом — хроматин — состоит из нуклеи-

43

новых кислот, которые являются хранителями наследственной информации и специальных белков.

Молекулярная структура ДНК была раскрыта в 1953 г. Дж.Уотсоном (США) и Ф.Криком (Великобритания), но детальное исследование продолжается и в настоящее время. Кодирующими элементами в ней служат всего четыре азотистых основания, расположенных попарно между двумя саха- ро-фосфатными нитями ДНК вдоль всей ее двуспиральной молекулы: аденин, гуанин-пурины, цитозин, тимин-пирими- дины. Они связаны между собой попарно: А—Т и Г—Ц (рис. 12). С помощью ДНК закодированы структуры клеточных белков, из которых построены все структуры и органеллы клетки (структурные белки) и которые определяют и обусловливают все клеточные функции: обменные (ферменты), регулирующие (гормоны), защитные (антитела), транспортные и т.д. На рис.13 условно показано распределение событий ионизации в зависимости от размеров молекулы ДНК для излучений с высокой и низкой ЛПЭ.

Ионизация вызывает три основных типа повреждения: одиночные и двойные разрывы нитей ДНК и повреждения азотистых оснований (рис.14). ДНК также подвержены постоянным повреждениям, которые обусловлены не только ионизирующим излучением, но и ультрафиолетовым излуче- нием, химическими агентами и т.д. Значительная часть энергии клетки как раз и расходуется для репарации, т.е. восстановления и поддержания постоянства последовательности оснований в ДНК (т.е. генетического кода). Однако не все повреждения ДНК равнозначны по последствиям, к которым они приводят.

Число одиночных разрывов линейно зависит от дозы облучения в очень широком диапазоне (от менее чем 0,2 Гр до 60 000 Гр). Другими словами, как бы ни мала была доза облу- чения, должно возникать определенное число разрывов одной из нитей ДНК.

44

Рис. 14. Три основных типа радиационных повреждений в молекуле ДНК:

1 – одиночные разрывы; 2 — двойные разрывы; 3 – повреждение оснований; 4 — исходная нормальная ДНК

Эффективность образования таких одиночных разрывов нитей может меняться в зависимости от многих биохимических факторов. При этом средняя энергия на один разрыв для излучения с низкой ЛПЭ составляет 1,6·10-18 _ 3,2·10-18 Дж (вспомним, что потенциал ионизации для кремния — порядка 5,76·10-19 Дж, а для воздуха — порядка 56·10-19 Äæ). Îáû÷-

45

но значительная часть одиночных разрывов нитей происходит с участием ОН — радикалов воды. Восстановление одиночных разрывов нитей ДНК в клетках млекопитающих происходит достаточно эффективно. Считают, что оно протекает по механизму эксцизионной репарации, который состоит в эксцизии (вырезании) части цепи, содержащей поврежденные звенья ДНК, и использовании комплементарной (неповрежденной) цепи в качестве матрицы для повторного синтеза нового отрезка ДНК взамен поврежденного. Процесс является ферментативным и зависит от температуры, а при 0°С значи- тельно замедляется. В клетках млекопитающих скорость репарации такова, что при нормальной температуре половина радиационных одиночных разрывов восстанавливается в тече- ние примерно 15 минут. Поскольку одиночные разрывы репарируются даже в летально облученных клетках, можно предположить, что они не являются причиной гибели клеток, в отличие от двойных разрывов или поврежденных оснований. Но такие нерепарированные одиночные разрывы вносят свой вклад в образование двойных разрывов, потому что двойные разрывы ДНК могут быть или результатом единичного события ионизации, или следствием совпадения одиночных разрывов в комплементарных цепях. Есть экспериментальные доказательства того, что и двойные разрывы могут репарироваться. Пока есть только теоретическая модель для объяснения возможного механизма репарации двойных разрывов ДНК, вызванных облучением.

Число повреждений азотистых оснований ДНК линейно зависит от дозы. Скорее всего, они возникают в результате взаимодействия со свободными радикалами воды ОН.

Повреждения азотистых оснований в клетках млекопитающих встречаются чаще, чем одиночные разрывы нитей ДНК, однако уже рассмотренный нами механизм эксцизионной репарации обеспечивает удаление поврежденных оснований. Нерепарированные повреждения оснований могут играть важную роль для клеток высших животных, а для простейших они являются значимыми факторами гибели.

В силу множества различных повреждающих факторов, репарация ДНК — основа нормального функционирования

46

клетки, но полная репарация происходит не всегда. Установлено, что уже при дозе 1 Гр в каждой клетке человека повреждается 5000 оснований молекул ДНК, возникает 1000 одиноч- ных и 10—100 двойных разрывов, каждый из которых может привести к неприятным последствиям.

Описываются, как правило, три вида репараций. Во-пер- вых, безошибочные репарации, главным образом эксцизионные, не вызывающие в дальнейшем летального исхода или мутаций. Репарации этого типа основаны на удалении поврежденного участка ДНК и замене его неповрежденными нуклеотидами, что приводит к восстановлению нормальной функции ДНК.

Во-вторых, ошибочные репарации, которые могут повлечь за собой нелетальные или летальные мутации. Это имеет место тогда, когда не происходит немедленной репарации повреждений. Они обходятся во время репликации ДНК, приводя к образованию пробелов в дочерних нитях. Затем эти пробелы заполняются отрезками материнской нити ДНК в процессе рекомбинации, а возникшая таким образом брешь материнской нити ДНК заполняется путем репаративного синтеза. В этом случае поврежденный участок фактически не репарируется, а обходится, и потерянная генетическая информация восполняется из дублированных запасов информации, содержащейся в клетке.

Пострепликативная репарация не играет какой-либо существенной роли в устранении радиационных повреждений ДНК в клетках млекопитающих.

В-третьих, существуют неполные репарации, когда непрерывность нитей ДНК не восстанавливается, и эта нерепарация может быть не только мутагенной, но даже летальной.

Является ли повреждение ДНК основной причиной гибели клеток? Пока однозначно ответить на этот вопрос не представляется возможным. Несомненно, повреждение ДНК дает толчок для повреждения генетического материала. Кроме того, известно, что повреждения белков и РНК являются менее критическими, чем повреждения ДНК.

Роль мембран в радиационной биологии остается мало изученной. Поскольку скорость взаимодействия мембранной

47

структуры и ее окружения лежит в определенных пределах, при больших мощностях дозы часть энергии излучения идет на поражение других структур, а часть расходуется «вхолостую», на поражение уже пораженных участков. При малых мощностях дозы почти все образовавшиеся под действием ионизирующего излучения активные продукты радиолиза воды разрушают мембраны, так как мембраны участвуют по- чти во всех жизненно важных процессах, происходящих в клетке. От состояния мембран во многом зависит и состояние иммунной системы. Кроме того, тесная связь между ДНК и внутренней мембраной ядра означает, что нельзя игнорировать мембрану в качестве критической структуры. В радиобиологии критическую структуру, ответственную за гибель клетки, называют мишенью.

Необходимо пояснить, что подразумевают радиобиологи под словами «гибель клетки».

Облучение клеток млекопитающих очень высокими дозами (несколько десятков грей) может вызвать мгновенное прекращение всех обменных процессов (метаболизма) и даже разрушение клетки. В этом случае говорят о немитотиче- ской или интерфазной гибели. При облучении гораздо более низкими дозами происходит подавление способности клеток делиться. Этот вид клеточной гибели, которую можно определить как потерю клеточной способности к неограниченному размножению, называют репродуктивной гибелью. Клетки, способные к ограниченному делению после облучения, дающие стерильное потомство, также считаются погибшими, несмотря на то, что с морфологической, физиологической и биохимической точек зрения они кажутся нормальными. Термин «репродуктивная гибель» применяют к клеткам делящимся, но постепенно деградирующим после облучения умеренными дозами, а также к клеткам, полностью утратившим репродуктивную способность. В отличие от немитотической гибели репродуктивную гибель иногда называют митотической. Далее, говоря о «гибели клеток», мы будем иметь в виду и те клетки, которые потеряли неограниченную репродуктивную способность. Как видно из

48

определения, термин «репродуктивная гибель» не относится к клеткам, которые вообще не делятся или делятся крайне редко. Утратившая способность делиться в результате облу- чения клетка не всегда имеет признаки каких-либо повреждений, она может жить еще долго и после облучения. Есть различные предположения, что большинство острых и отдаленных эффектов облучения — результат послерадиационной митотичеокой гибели клеток, которая проявляется при попытке таких «погибших» клеток к делению.

Графическое представление зависимости доли выживших клеток от дозы облучения называется кривой выживаемости. Для изображения кривых выживаемости используют либо линейную зависимость, либо полулогарифмическую. На рис.15 показаны оба вида кривых выживаемости.

Рис.15. Линейная зависимость числа погибших вирусов Nn от дозы облучения (а) и полулогарифмическая зависимость числа выживших вирусов Nâ от дозы облучения (б)

В 1956 г. были получены кривые выживаемости для популяции клеток млекопитающих. На рис.16 показана схема опытов. Для опытов по определению кривых выживаемости используются две серии чашек Петри — облучаемая и контрольная. Это необходимо для того, чтобы избежать погрешностей, связанных с условиями эксперимента и природой самих леток.

Обычно количество высеваемых в чашку Петри клеток, способных образовать колонии, невелико, где-то порядка сот-

49

ни. Это количество ограничено размерами вырастающих колоний и удобством подсчета количества колоний. По законам же статистики, чем больше выборка, т.е. чем больше колоний подсчитано, тем меньше погрешность эксперимента. Поэтому в опытах используют не одну чашку, а сразу несколько, т.е. серию. Результаты подобного эксперимента показаны на рис.17. Для описания формы кривых выживаемости используют теорию мишени. В этой теории используют три модели. Первая — простая многомишенная модель — предполагает, что две или более мишени должны получать одно попадание, прежде чем клетка погибнет. Вторая — многомишенная одноударная модель — предполагает, что существует много процессов, ведущих к гибели клеток. Особенность ее в том, что она предусматривает ненулевой начальный наклон при облу- чении низкими дозами на участке, предшествующем экспоненциальной части кривой, т.е. учитывается гибель клеток даже при облучении самыми низкими дозами. Третья модель описывает кривые выживаемости в форме непрерывно изогнутой кривой, задаваемой линейно-квадратичным уравнением.

Рис.16. Схема опытов для определения выживаемости клеток млекопитающих после облучения

50