Студентам IV, V курса / Руководство по лаб. методам диагностики A.A.Кишкун

522 ■ Глава 8

Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекционных заболеваний

ПЦР — один из методов ДНК-диагностики, позволяющий увеличить количество копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на две цепи, затем в присутствии синтезированных ДНКпраймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа — синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы — позволило тестировать РНК-вирусы, например вирус ВГС. ПЦР — трёхступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом ИФА или электрофореза.

В ПЦР можно использовать различный биологический материал — сыворотку или плазму крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральную жидкость, ликвор и т.д. В первую очередь ПЦР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как ВГВ, ВГС, ВГD, ЦМВ-инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путём (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулёз, ВИЧинфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

■возбудитель инфекции можно обнаружить в любой биологической среде организма, в том числе и материале, получаемом при биопсии;

■возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;

■возможна количественная оценка результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);

■высокая чувствительность метода; например, чувствительность ПЦР для

выявления ДНК вируса ВГВ в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4×102 копий/мл), в то время как чувствительность метода гиб-

ридизации ДНК с использованием разветвлённых зондов — 2,1 пг/мл (приблизительно 7×105 копий/мл).

Обнаружение вируса гепатита С

HCV в материале в норме отсутствует.

В отличие от серологических методов диагностики ВГС, где обнаруживают АТ к HCV, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно РНК HCV и количественно выразить его концентрацию в исследуемом материа-

Серологические исследования ■ 523

ле. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность: десяти молекул РНК HCV в исследуемом материале достаточно для его выявления. Обнаружение АТ к HCV подтверждает лишь факт инфицирования пациента, но не позволяет судить об активности инфекционного процесса (о репликации вируса) и прогнозе заболевания. Кроме того, АТ к HCV обнаруживают как в крови больных острым и хроническим гепатитом, так и у тех пациентов, кто болел и выздоровел, а нередко АТ в крови появляются только через несколько месяцев после появления клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику. Обнаружение HCV в крови с использованием ПЦР — более информативный метод диагностики. Выявление в ПЦР РНК HCV свидетельствует о виремии, позволяет судить о репликации вируса в организме и служит одним из критериев эффективности противовирусной терапии. Обнаружение РНК HCV с помощью ПЦР на ранних этапах развития вирусной инфекции на фоне полного отсутствия каких-либо серологических маркёров может служить самым ранним свидетельством инфицирования. Однако изолированное выявление РНК HCV на фоне полного отсутствия каких-либо других серологических маркёров не может полностью исключить ложноположительный результат ПЦР.

Втаких случаях необходима всесторонняя оценка клинических, биохимических и морфологических исследований с повторным неоднократным подтверждением наличия инфекции ПЦР. Алгоритм диагностики ВГС с использованием метода ПЦР приведён на рис. 8-19.

Большое значение имеет применение метода ПЦР у больных с хроническим ВГС, так как у большинства из них отсутствует корреляция между наличием вирусной репликации и активностью печёночных ферментов. В таких случаях только ПЦР позволяет судить о наличии вирусной репликации, особенно если конечный результат выражают количественно.

Вбольшинстве случаев заболевания исчезновение из сыворотки крови РНК HCV происходит позже нормализации печёночных ферментов, поэтому их нормализация не может служить основанием для прекращения противовирусного лечения.

Практически важно для выявления РНК HCV исследовать методом ПЦР

не только сыворотку крови, но и лимфоциты, гепатобиоптаты. Вирусы удаётся обнаружить в 2−3 раза чаще в ткани печени, чем в сыворотке крови. При оценке результатов исследования сыворотки крови на РНК HCV следует помнить, что виремия может носить флюктуирующий характер (как и изменение активности ферментов). Поэтому после положительных результатов исследования ПЦР можно получить отрицательный результат и наоборот. В таких случаях для разрешения возникающих сомнений лучше исследовать гепатобиоптаты.

Обнаружение РНК HCV в материале с помощью ПЦР используют в следующих целях:

■разрешение сомнительных результатов серологических исследований;

■дифференциация ВГС от других форм гепатита;

■выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесённой инфекцией или контактом; определение стадии инфицированности новорождённых от серопозитивных по HCV матерей;

■контроль эффективности противовирусного лечения.

Серологические исследования ■ 525

Все вышеизложенные особенности оценки результатов и подходов к диагностике HCV с использованием ПЦР относятся и к другим инфекциям.

Метод ПЦР позволяет не только выявить РНК HCV в исследуемом материале, но и установить его генотип. Определение генотипа вируса имеет большое значение для подбора пациентов с хроническим ВГС к проведению лечения интерфероном-альфа и рибавирином. Лабораторные показания к лечению хронического ВГС интерфероном альфа следующие:

■повышение активности трансаминаз;

■наличие РНК HCV в крови;

■генотип 1 HCV;

■высокая виремия в крови (более 8×105 копий/мл).

В настоящее время можно количественно определять содержание РНК HCV в сыворотке крови методом ПЦР, что имеет большое значение для конроля за лечением интерфероном альфа. Уровень виремии оценивают следующим образом: при содержании РНК HCV от 102 до 104 копий/мл — слабая; от 105 до 107 копий/мл — средняя, выше 108 копий/мл — высокая. При эффективном лечении уровень виремии снижается.

Обнаружение вируса гепатита В

HBV в материале в норме отсутствует.

Примерно 5−10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлено хроническим ВГВ. Маркёрами активности таких заболеваний служат HBeAg и ДНК вируса в сыворотке крови.

ПЦР позволяет определять в исследуемом материале (крови, пунктате печени) ДНК HBV как качественно, так и количественно. Качественное определение HBV в материале позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает патогенез заболевания. Количественный метод определения содержания ДНК HBV в исследуемом материале даёт важную информацию об интенсивности развития заболевания, эффективности лечения и развитии резистентности к антивирусным препаратам. Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови в настоящее время применяют тест-системы, их чувствительность составляет 50−100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5×103−104 копий/мл. ПЦР при вирусном ВГВ безусловно необходима для суждения о вирусной репликации. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК HBV может служить сыворотка крови, а также лимфоциты и гепатобиоптаты. Оценка результатов исследования на ДНК HBV во многом аналогична описанному для ВГС.

Обнаружение ДНК HBV в материале с помощью ПЦР необходимо

вследующих случаях:

■разрешение сомнительных результатов серологических исследований;

■выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесённой инфекцией или контактом;

■контроль эффективности противовирусного лечения.

Существует зависимость между исходом острого ВГВ и концентрацией ДНК HBV в крови больного. При низком уровне виремии (менее 0,5 пг/мкл) процесс хронизации инфекции близок к нулю, при концентрации ДНК HBV от 0,5 до 2 пг/мл хронизация процесса происходит у 25−30% больных,

Серологические исследования ■ 527

активности процесса и коррелирует с максимумом воспалительно-некро- тических изменений в печени.

Обнаружение вируса гепатита Е

РНК HEV появляется в крови через 2−3 нед после заражения. Вирусемия свидетельствует о факте заражения и длится в среднем в течение 3 мес,

ав части случаев — до 6 мес.

При ВГЕ в ранние стадии заболевания вирусную РНК методом ПЦР

можно выявить у 75% больных в сыворотке крови. Нередко РНК обнаруживают даже в инкубационный период инфекции.

Обнаружение вируса гепатита G

Обнаружение в крови РНК HGV методом ПЦР служит основным лабораторным методом диагностики этой формы вирусного гепатита. Выявление РНК HGV в крови указывает на активное течение заболевания.

Обнаружение цитомегаловируса

Обнаружение частиц вируса в крови больного с помощью ПЦР используют для диагностики ЦМВ-инфекции и контроля эффективности противовирусного лечения. В отличие от серологических методов диагностики ЦМВ-инфекции, при которых выявляют АТ к ЦМВ, ПЦР позволяет выявить наличие непосредственно ЦМВ и количественно выразить его концентрацию в сыворотке крови. Выявление ЦМВ имеет большое значение в диагностике перинатальной патологии. Внутриутробная и перинатальная передача ЦМВ может иметь тяжёлые последствия. ЦМВ-инфекция во время беременности часто протекает в субклинической форме и сопровождается относительно невыраженными симптомами. ПЦР в таких случаях позволяет выявить этиологический фактор заболевания. Материалом для исследования могут служить клетки осадка мочи (новорождённых детей), эпителий цервикального канала больных женщин, околоплодные воды, соскобы с конъюнктивы глаз и урогенитального тракта, слюна, пунктаты печени.

Обнаружение вируса простого герпеса типов 1 и 2

В последнее время для диагностики герпетической инфекции используют выявление ДНК ВПГ 1 и 2 в материале из везикул и язв кожных покровов или слизистых оболочек (включая конъюнктиву глаз) методом ПЦР (очень чувствительный, специфичный и быстрый метод диагностики). Этот метод можно использовать для выявления вируса в ликворе. Отрицательный результат ПЦР не позволяет исключить герпетическую инфекцию, так как из-за короткого репродуктивного цикла возбудителя (в эпителиальных клетках составляет всего 20 ч) материал для исследования может быть взят слишком рано или поздно. Положительный результат ПЦР свидетельствует только о наличии вируса в организме человека, но не позволяет отличить носительство от активно текущей инфекции.

Обнаружение вируса папилломы человека

Вирусы папилломы человека (human papillomavirus — HPV) — малые ДНК-содержащие онкогенные вирусы, инфицирующие эпителиальные

528 ■ Глава 8

клетки и индуцирующие пролиферативные поражения. В настоящее время выделено более 70 типов вируса папилломы человека. Эпидемиологический анализ данных исследований на наличие вируса папилломы человека позволил выдвинуть концепцию об участии вирусов этой группы в развитии эпителиальных злокачественных новообразований. Типы вируса папилломы человека, выявляемые при различных поражениях кожи и слизистых оболочек, приведены в табл. 8-8.

Таблица 8-8. Типы вируса папилломы человека, выявляемые при различных поражениях кожи и слизистых оболочек

Более 90% всех цервикальных карцином позитивны на присутствие вирусов папилломы человека. Наиболее часто в материале из опухолей шейки матки обнаруживают типы вирусов 16 и 18.

Вирусы папилломы человека типа 6 и 11 признаны этиологическим началом рецидивирующего респираторного папилломатоза, обычно поражающего носоглотку, трахею, гортань, способного прогрессировать и стать распространённым бронхопульмональным заболеванием. В большинстве случаев папилломатоз бывает доброкачественным, однако может трансформироваться в плоскоклеточную карциному.

ДНК вируса папилломы человека типа 16 часто выявляют в клетках урогенитальной карциномы у пациентов с иммунодефицитом.

Единственный метод обнаружения вирусов папилломы человека при перечисленных заболеваниях — метод ПЦР. Материалом для исследования служат пунктаты опухолей, лимфатических узлов, отделяемое из влагалища, носа, трахеи, моча. Обнаружение в исследуемом материале вируса папилломы человека определённого типа ещё не говорит о наличии у пациента злокачественной опухоли, но требует проведения гистологического исследования субстрата болезни и последующего динамического наблюдения за ним. Те женщины, у которых длительно персистирует вирус папилломы

Серологические исследования ■ 529

человека в шейке матки, имеют примерно в 65 раз более высокий риск развития рака шейки матки. Риск ещё выше (130-кратный) у женщин старше 30 лет, если они инфицированы типами 16 или 18 вируса папилломы человека.

Высказывают мнение о важной роли обнаружения вирусов папилломы человека в биоптатах лимфатических узлов при цервикальной карциноме для определения объёма оперативного лечения и выявления интактных и поражённых метастазами лимфатических узлов. При нахождении вирусов папилломы человека в лимфатических узлах, даже при отсутствии гистологических признаков их опухолевого поражения, результаты исследования необходимо расценивать, как наличие метастазов в лимфатические узлы.

По результатам исследований на вирус папилломы человека методом ПЦР, проведённых до и после лечения, можно оценивать его эффективность.

Обнаружение микобактерий туберкулёза

Микобактерии туберкулёза в материале в норме отсутствуют.

В отличие от серологических методов диагностики туберкулёзной инфекции, выявляющих АТ к микобактериям туберкулёза, ПЦР позволяет обнаружить непосредственно ДНК микобактерий туберкулёза и количественно выразить их концентрацию в исследуемом материале. Исследуемым материалом может быть мокрота, лаважная жидкость, моча, пунктаты из различных органов и кист и др. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность (более 95%). Микробиологическая диагностика туберкулёза в настоящее время — основной метод выявления больных и мониторинга эффективности лечения. Однако микробиологические анализы на туберкулёз чрезвычайно продолжительны и имеют низкую чувствительность (выявление положительных проб не превышает 50%). Диагностика туберкулёза с помощью ПЦР имеет большое диагностическое значение (время исследования составляет 4−5 ч). Для детекции ДНК достаточно, чтобы в исследуемом материале было около 10 микобактерий. Обнаружение ДНК микобактерий туберкулёза в материале с помощью ПЦР необходимо в следующих случаях:

■быстрое обнаружение источника инфекции;

■диагностика лёгочного туберкулёза;

■диагностика туберкулёза внелёгочной локализации;

■контроль эффективности противотуберкулёзного лечения;

■раннее выявление рецидивов.

Вместе с тем следует отметить, что применение ПЦР для диагностики туберкулёза не заменяет бактериологического метода.

Обнаружение Helicobacter pylori

Helicobacter pylori в исследуемом материале в норме отсутствует.

Helicobacter pylori отводят ведущую роль в этиологии хронического гастрита, язвенной болезни.

Материалом для исследования служат биоптаты слизистой оболочки желудка и кал. Диагностическая чувствительность ПЦР для выявления Helicobacter pylori в биоптатах слизистой оболочки желудка составляет

530 ■ Глава 8

88−95,4%, специфичность — 100%; в копрофильтратах — 61,4−93,7% и 100% соответственно [Makristathis A. et al., 1998; Watanabe T. et al., 1998].

Обнаружение гонококков

Гонококки в материале из уретры в норме отсутствуют.

ПЦР позволяет установить наличие непосредственно ДНК гонококков и количественно выразить их концентрацию в исследуемом материале. Исследуемым материалом могут быть мокрота, лаважная жидкость, моча, пунктаты из различных органов и кист и др. Тест имеет видовую специфичность и высокую чувствительность (более 95%). ПЦР-диагностика гонореи даёт положительные результаты даже при хронических формах заболеваний, когда результаты бактериоскопических и бактериологических исследований отрицательны.

Обнаружение гонококков в материале с помощью ПЦР используют для диагностики гонококковой инфекции и контроля эффективности лечения.

Обнаружение микоплазм

Микоплазмы в исследуемом материале в норме отсутствуют.

Микоплазмы относят к условно патогенным микроорганизмам. Они персистируют и паразитируют на мембранах эпителиальных клеток и могут локализоваться как экстра-, так и интрацеллюлярно. Известно около 11 видов микоплазм, для которых человек служит естественным хозяином. Из них клиническое значение имеют M. hominis, M. pneumoniae, M. genitalium, M. fermentas, U. urealyticum.

Метод ПЦР выявляет непосредственно ДНК микоплазм в исследуемом материале. Для обнаружения микоплазм при заболеваниях лёгочной системы лучшим материалом для ПЦР служит жидкость, полученная в процессе бронхиального лаважа. При заболеваниях мочевыводящего тракта исследуют мочу, отделяемое из уретры, влагалища, цервикального канала, сок предстательной железы. Наиболее часто при урогенитальных инфекциях обнаруживают U. urealyticum — в 20−50% случаев, M. hominis — в 10−25%.

Обнаружение Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis в материале из уретры в норме отсутствуют. Диагностика хламидиоза с помощью ПЦР — наиболее чувствительный

и специфичный метод из всех, используемых в лабораториях в настоящее время. Чувствительность метода составляет 95−97%, а специфичность — 95−98%. Обнаружение Chlamydia trachomatis в материале из уретры с помощью ПЦР используется в следующих случаях:

■скрининг в популяции с высоким риском инфицирования;

■обнаружение Chlamydia trachomatis в моче;

■разрешение сомнительных результатов других методов исследования;

■контроль эффективности проводимого лечения.

При урогенитальных инфекциях Chlamydia trachomatis в материале из уретры методом ПЦР обнаруживают в 15−40% случаев. Chlamydia trachomatis играют важную роль в развитии хронического простатита. Наибольший интерес в этом плане представляют случаи абактериального хронического простатита. Материалом для исследования могут служить секрет предстательной железы, полученный после её массажа, эякулят, биоптат.

Глава 9

Гормональные исследования

Гормоны — группа соединений различной химической структуры, характеризующихся способностью после выделения из клеток, в которых они образуются, достигать клеток-мишеней (чаще всего с кровью) и путём связывания со специфическими белковыми молекулами клеток-мишеней (рецепторами) вызывать в последних более или менее специфические изменения метаболизма. У человека описаны приблизительно 100 гормонов. После инактивации гормоны выводятся из организма в неактивной форме. Скорость образования и разрушения гормонов зависят от потребностей организма.

Основные места синтеза гормонов — гипоталамус, передняя и задняя доли гипофиза, щитовидная и паращитовидная железы, островки поджелудочной железы, кора и мозговой слой надпочечников, половые железы, плацента, определённые клетки ЖКТ, головного мозга, миокарда, жировой ткани. Гормоны также могут образовывать опухоли неэндокринных тканей (так называемая эктопическая продукция гормонов).

Транспорт гормонов осуществляется кровью. Большинство гормонов (особенно белковой и пептидной природы) хорошо растворимы в воде, следовательно, и в плазме крови. Исключение составляют T4 и стероидные гормоны. Они транспортируются кровью с помощью специальных белков носителей. Растворимость и взаимодействие с носителем влияют на период полураспада гормонов в крови. Большинство пептидных гормонов имеют очень короткий период полураспада — 20 минут и меньше. Гидрофобные стероидные гормоны имеют значительно больший период полураспада (кортизол приблизительно 1 ч, T4 — 7 дней).

Гормоны циркулируют в крови в очень низких концентрациях (обычно приблизительно 10−6−10−9 моль/л), но количество молекул, соответствующих этой концентрации, огромно (1017−1014 молекул/л) — практически триллионы молекул в 1 л крови. Это огромное количество молекул гормонов делает возможным их влияние на каждую отдельную клетку организма

ирегуляцию её специфических метаболических процессов. Циркулирующие гормоны не действуют на все клетки одинаково. Избирательность действия гормонов обеспечивают специфические рецепторные белки, локализованные на клеточной мембране или в цитоплазме клеток-мишеней. Количество рецепторов на клеточных мембранах может составлять тысячи

идаже десятки тысяч. Количество рецепторов на клетке-мишени непостоянно и регулируется, как правило, действием соответствующих гормонов. Обычно, при постоянно повышенной концентрации гормона в крови, количество его рецепторов уменьшается. Специфичность рецепторов во многих случаях невысока, поэтому они могут связывать не только гормоны, но

исоединения, похожие на них по структуре. Последнее обстоятельство может стать причиной нарушения гормональной регуляции, проявляющейся резистентностью тканей к действию гормонов.