[Мікробіологія] Лекції / #2 med-physiology
.pdf
Тесты для автоматического определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам ATB и rapid ATB
Автоматические бактериологические анализаторы
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ БЕЗ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
•Идентификация без выделения чистой культуры микроорганизмов необходима для детекции возбудителей непосредственно в биологическом материале, что позволяет проводить экспресс-диагностику заболеваний, а также выявлять некультивируемые микроорганизмы.
•Используют два подхода: генетический и серологический.
Реакция прямой и непрямой иммунофлюоресценции
Иммуно-ферментный анализ
|
|
Материал, содержащий |
Антитела |
против |
антиген |
Аг* сорбированы в |
|
|
лунке планшета |
|
|
Антитела против Аг*, коньюгированные с ферментом
Окрашенный продукт 
Бесцветный субстрат 
Измерение оптической плотности на ИФА-ридере
*Антитела к различным эпитопам искомого антигена
Схема твердофазного ИФА для определения антигена
Иммуно-ферментный анализ
Антиген сорбирован в лунке планшета
Антитела в материале
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Антитела против Ig |
|
|
|
Окрашенный |
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
человека, коньюги- |
|||||||
|
|
продукт |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
рованные с ферментом |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Бесцветный |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
субстрат |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Измерение оптической плотности на ИФА-ридере
Схема твердофазного ИФА для определения антител
SDS-PAGE electrophoresis, Western blot analysis
Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, Western blot) —
аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце.
•На первом этапе использует электрофорез белков
полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило,
вприсутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии).
•Далее белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF,
•затем детектируются с использованием антител, специфичных к заданному белку
Анализ гелей
Методы, основанные на гибридизации
нуклеиновых кислот
Цель
Выявление степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)
Молекулярная гибридизация – метод,
основанный на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-
свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Принцип осуществления
исследуемая ДНК
нагрев в щелочной среде
расплетение на две отдельные нити
закрепление одной из них на специальном фильтре
помещение этого фильтра в р-р, содержащий известный радиоактивный или флюоресцентный зонд (оц ДНК эталонного
штамма, меченную рад. изотопом или флюор.кр.)
понижение температуры
+восстановление двойной спирали
–двойная спираль не восстанавливается