Зарипова Концепции

способ выделения вредного гена из ДНК. Можно заменить ошибочный ген на правильный при помощи ферментов, переносимых специальным вирусом.

Генетическая инженерия и биотехнологии

"Генетическая или генная инженерия" - создание новых генетических структур и создание организмов с новыми наследственными свойствами. С помощью биохимических и генетических методик происходит изменение хромосомного материала - основного наследственного вещества клеток. Биоинженеры изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть.

Генная инженерия принципиально отличается от классической селекции по следующим пунктам:

1)Можно (нельзя) скрещивать неродственные виды;

2)Можно (нельзя) извне управлять процессом рекомбинации в организме (постоянство своего генетического состава организм очень надежно охраняет);

3)Можно (нельзя) предугадать, какое получится потомство.

Ученым было необходимо разработать методику введения гена в клетку. Причѐм нужно было научиться не просто вводить ген в цитоплазму, а встраивать его в собственную молекулу ДНК клетки, так, чтобы новая информация могла быть "прочитана" биосинтетическим аппаратом клетки, вырабатывающим белки, а также воспроизводящим гены при делении клетки. Новый ген (или его фрагмент) должен очень точно располагаться в ДНК с соблюдением ряда условий, для того чтобы клетка действительно начала синтезировать новые ферменты. Надо было также обойти сопротивляемость клетки-хозяина: как правило, все изменения генетического аппарата воспринимаются клеткой как "ошибки информации" и исправляются специальными механизмами.

(Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью еѐ обменных механизмов начинает синтезировать "свой" белок. Учѐные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку.)

Важное открытие - обнаружение в бактериальных клетках, помимо главной ее хромосомы, внехромосомных кольцевых молекул ДНК - плазмид. Плазмиды можно извлечь из одной клетки и перенести в другую. Плазмиды можно разрезать, фрагменты сращивать друг с другом, а затем такие комбинированные плазмиды вводить в клетки. Поскольку плазмидная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую молекулу, кольцо нужно сперва разорвать таким образом, чтобы свободные концы были в химическом отношении реакционноспособными, пригодными для последующего соединения. Достичь этого удается либо простым механическим путем (например, сильным встряхиванием),

либо с помощью различных ферментов, называемых нуклеазами (рестриктазами).

Затем фрагменты ДНК соединяют с помощью лигаз - ферментов, исправляющих повреждения в ДНК и сшивающих (склеивающих) концы ее разорванных нитей.

Рестриктазы-ферменты - способны расщеплять ДНК в строго определенном месте с образованием "липких" концов у образуемых фрагментов. Иными словами, с помощью

141

рестриктаз ген можно разрезать на кусочки - нуклеотиды, а затем с помощью лигаз такие кусочки можно "склеивать", соединять в иной комбинации, конструируя новый ген.

Как осуществляется введение генных конструкций в бактериальную клетку?

Сначала плазмиды режут рестриктазами и получают односпиральные концы, комплементарные концам генов, проводят гибридизацию гена и плазмиды в пробирке, а затем рекомбинантную плазмиду вводят в клетку. Плазмиды содержат маркерный ген, например ген, сообщающий клетке устойчивость к определенному антибиотику. В рекомбинантных клетках плазмида участвует в процессах репликации, транскрипции и трансляции нового введенного в клетку гена. Синтезируется продукт этого гена, который в природных клетках никогда ранее не мог образоваться.

Подчеркнем, что in vitro проводится только рекомбинация, а все остальные превращения с плазмидой происходят в клетке так же, как и со своими собственными генами.

Итак, основные процедуры в генной инженерии сводятся к следующему: 1)рекомбинация плазмиды и ДНК-гена; 2)введение рекомбинантной плазмиды в клетку;

3)молекулярное клонирование (технология клонирования наименьших биологических объектов - молекул ДНК, их частей и даже отдельных генов).

Достижения генной инженерии

Технологии генной инженерии разрабатываются не очень много времени, они имеют крупные достижения и в медицине, и в сельском хозяйстве. Методом генной инженерии получен уже ряд препаратов, в том числе инсулин человека и противовирусный препарат интерферон. Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения. В сельском хозяйстве с помощью рекомбинантной ДНК могут быть получены трансгенные растения, например сорта культурных растений, устойчивые к засухе, холоду, болезням, насекомым-вредителям и гербицидам. Несколько слов о перспективах генной инженерии. На основе детального анализа возможностей и реальных достижений генной инженерии составлены научные прогнозы на начало ХХI века. Высказаны, например, надежды, что в ближайшие годы будут разработаны препараты для лечения такого опасного заболевания, как СПИД, к 2009 году будут определены гены, которые связаны со злокачественными новообразованиями, а к 2010 году будут установлены механизмы возникновения почти всех видов рака. К 2013 году завершится разработка препаратов, предотвращающих рак. Не менее важна сегодня генная диагностика. Обычно молекулярная диагностика проводится по белкам, и, как правило, с помощью других белков-антител. Недостатки такой диагностики - обнаружение болезни на поздней стадии. Но теперь можно диагностировать и по генам (ДНК), и по синтезированным на них РНК еще до того, как в организме начали синтезироваться и накапливаться чужеродные белки. Не имея возможности детально останавливаться на генной терапии, кратко перечислим некоторые проблемы, которыми занимаются ученые: - блокировка или разрушение вредного гена либо блокировка продуцируемой им РНК с помощью антисмысловых ДНК или РНК, - введение нового активного гена или регулятора активности гена. Лечение наследственных болезней целиком зависит от успехов в этом направлении, - введение генов или комплексов генов, блокирующих клеточное деление или вызывающих клеточную смерть,

142

как средство кардинальной раковой терапии. Отметим также важность биотехнологии для техники: например, создание биосенсоров на основе биологических макромолекул или конструирование биологически возобновляемых источников энергии.

Клонирование животных

Напомним, что клонирование в биологии - метод получения нескольких идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. Эти копии должны обладать идентичной наследственной информацией, т.е. нести идентичный набор генов.

Однако сейчас термин "клонирование" обычно используется в более узком смысле и означает копирование клеток, генов, антител и даже многоклеточных организмов в лабораторных условиях. Появившиеся в результате бесполого размножения экземпляры по определению генетически одинаковы, однако и у них можно наблюдать наследственную изменчивость, обусловленную случайными мутациями или создаваемую искусственно лабораторными методами

Наибольший интерес представляет клонирование многоклеточных организмов, которое стало возможным благодаря успехам генной инженерии. Создавая особые условия и вмешиваясь в структуру ядра клетки специалисты заставляют развиваться еѐ в нужную ткань или даже в целый заранее намеченный организм. Причѐм открыты не только методы воспроизведения того организма, из которого клетка была взята, но и другого организма - того, от которого был взят только генетический материал. Появилась принципиальная возможность воспроизведения даже умершего организма. И даже тогда, когда от него остались минимальные части - лишь бы из них можно было выделить генетический материал.

Клонирование животных возможно с помощью экспериментальных манипуляций с яйцеклетками (ооцитами) и ядрами соматических клеток животных in vitro и in vivo подобно тому, как в природе появляются однояйцевые близнецы. В окончательном виде проблема клонирования животных была решена группой Вильмута в 1997, когда родилась овца по кличке Долли - первое млекопитающее, полученное из ядра взрослой соматической клетки: собственное ядро ооцита было заменено на ядро клетки из культуры эпителиальных клеток молочной железы взрослой лактирующей овцы.

Однако отметим, что успех сопутствовал лишь в одном из 236 опытов (!). В дальнейшем были проведены успешные эксперименты по клонированию различных млекопитающих с использованием ядер, взятых из взрослых соматических клеток животных (мышь, коза, свинья, корова).

Дальнейшие эксперименты доказали, что в некоторых случаях ядра соматических (не зародышевых) клеток способны обеспечить нормальное развитие млекопитающих (что было показано на мышах).

Однако получение клона еще не означает получения точной копии клонированного животного. Например, в случае использования приемных матерей при клонировании млекопитающих невозможно обеспечить одинаковые условия, а значит трудно говорить об абсолютной точности клонирования исходной особи. На сегодняшний день ясно, что структурно-функциональные изменения ядер в ходе индивидуального развития животных достаточно глубоки: одни гены активно работают, другие "молчат". И чем организм более специализирован, чем выше ступенька эволюционной лестницы, на которой он стоит, тем эти изменения глубже и труднее обратимы.

143

Недавно было показано, что в соматических клетках в ходе их развития хромосомы последовательно укорачиваются на своих концах, а в зародышевых клетках специальный белок - теломераза достраивает, восстанавливает их.

Поэтому естественен вопрос, способны ли ядра соматических клеток полностью и эквивалентно заменить ядра зародышевых клеток в их функции обеспечения нормального развития зародыша.

Различают полное и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаѐтся весь организм целиком, при частичном - организм воссоздаѐтся - соответственно - не полностью. Например, лишь те или иные его ткани. Одно из перспективных применений клонирования тканей - клеточная терапия в медицине. Такие клетки могли бы компенсировать недостаток и дефекты собственных тканей организма и не отторгаться при трансплантации. Это так называемое репродуктивное и терапевтическое клонирование.

Наверное, можно говорить, что в принципе техническая задача получения клонированных животных решена, однако насколько точно эти животные копируют прототип - этот вопрос остается открытым.

144

Глава 14. Клетка - структурная и функциональная единица живого

История учения о клетке

Клетка является мельчайшей системой, обладающей всей совокупностью свойств живого, в том числе способностью передавать информацию.

Таблица 14.1.

Основные положения клеточной теории

Положения:

1.Все живые организмы состоят из клеток, сходных по своему строению,

(кроме прокариотов, которые не имеют типичных для большинства клеток структур).

2.Клетки размножаются путем деления.

3.Все процессы, происходящие в клетках на молекулярном уровне, сходны у всех живых организмов.

Самые простые - прокариотические клетки - безъядерные клетки.

Рис. 14.1. Схема строения прокариотической клетки.

145

В цитоплазме находятся молекулы ДНК, рибосомы и различные включения в виде гранул липидов и других веществ.

Однако прокариотические клетки - это уже одноклеточные организмы, например, бактерии и сине-зеленые водоросли.

Размеры клеток варьируют в значительных размерах. Диаметр яйцеклетки страуса

– 75 мм, микроплазменная клетка имеет размеры 0.1-0.25 мкм. Формы клеток также могут быть различными.

Рис. 14.2. Формы клеток.

1- яйцеклетка, 2- эпителиальная клетка полости рта, 3- замыкающие клетки устьиц, 4-эпителий мыши, 5- сосудистая клетка древесины, 6- клетка мерцательного эпителия, 7- клетка гладких мышц, 8- нервная клетка спинного мозга, 9- пигментная клетка кожи лягушки.

Строение клетки

Более сложные - эукариотические (ядерные) клетки

Рис. 14.3. Схема строения ядерной клетки

146

1.Мембрана - регулирует обмен различными веществами между клеткой и внешней средой.

2.Цитоплазматический матрикс - водная фаза с белковыми макромолекулами: - ядро, митохондрии, рибосомы и др.

3.Ядерная мембрана - отделяет ядро от цитоплазмы.

4.Ядро - содержит одно или два ядрышка, состоящих из РНК.

5.Ядрышко

6.Хромосомы - в ядре (палочки, нити, петли). Количество хромосом в клетках постоянно. В хромосоме - молекула ДНК

7.Рибосомы - состоят из белка и РНК. На рибосомах происходит синтез белка.

8.Митохондрии - структуры в виде палочек, нитей или гранул. В них питательные вещества окисляются, а высвобождаемая при этом энергия запасается в АТФ (аденозин-трифосфат).

9.Лизосомы.

В растительных клетках - органеллы - хлоропласты, в которых содержится хлорофилл.

Недавно ученым удалось получить трехмерную фотографию клетки.

Рис.14.4. Фотография дрожжевой клетки.

Здесь показана полная электронная томограмма дрожжевой клетки: плазменная мембрана, микротрубочки и светлые вакуоли (зелѐный цвет), ядро, тѐмные вакуоли и тѐмные везикулы (золотой), митохондрия и крупные темные везикулы (голубой), а также светлые везикулы (розовый).

Вспомним, из чего состоит клетка?

В ней более 70 элементов, но лишь 12 из них (кислород, углерод, водород, азот, кальций, фосфор, кремний, сера, натрий, хлор, калий, железо) встречаются в большом количестве.

Вода - 70% массы протоплазмы.

Основные органические соединения клетки - углеводы, липиды, белки, нуклеиновые кислоты и стероиды.

147

Углеводы (углеводороды) - соединения углерода, водорода и кислорода с общей формулой Cn(H2O)n. К углеводам относятся, например, моносахариды и полисахариды

(С6Н10О5)n).

Моносахариды - группа содержит рибозу и дезоксирибозу - сахара, входящие в состав мономеров нуклеиновых кислот РНК и ДНК. Сюда же относятся глюкоза (виноградный сахар) и фруктоза. Главными углеводами протоплазмы являются глюкоза (у животных), и крахмал (у растений)

Полисахариды - целлюлоза и клетчатка.

В биосфере углеводов больше, чем всех других органических соединений вместе взятых. В растительном мире на их долю приходится 80-90% из расчета на сухое вещество

1.Энергетическая. Окисляясь в процессе дыхания, углеводы выделяют заключенную в них энергию и обеспечивают значительную часть потребности организма в ней. При окислении 1г углеводов выделяется 16,9 кДж энергии.

2.Пластическая. Углеводы используются для синтеза многих важных для организма веществ: нуклеиновых кислот, органических кислот, а из них - аминокислот и далее белков, липидов и т. д.

3.Защитная. Углеводы-основные компоненты оболочек растительных тканей, они участвуют в построении наружного скелета насекомых и ракообразных, в образовании клеточных стенок бактерий и клеточных мембран всех живых организмов.

4.Опорная. Целлюлоза и другие полисахариды оболочек растений не только защищают клетки от внешних воздействий, но и образуют прочный остов растения. В комплексе с белками углеводы входят в состав хрящевых тканей человека и животных.

5.Специфические функции углеводов. Углеводы определяют антигенную специфичность, обусловливают различия групп крови и др.

Углеводы выполняют также функцию запасных питательных веществ. Образование углеводов происходит в растениях в процессе фотосинтеза и в

микроорганизмах в процессе хемосинтеза.

Человек и животные не способны к первичному биосинтезу углеводов из неорганических веществ, они могут лишь образовывать их в процессе глюконеогенеза из других органических веществ (органических кислот, жиров, аминокислот), но главным источником углеводов является пища. Углеводы составляют существенную часть рациона человека и многих животных. На их долю приходится 60-70% общей суммы калорий пищи человека. Углеводы всасываются через слизистую оболочку кишечника только в виде моносахаридов. Для расщепления и переваривания крупных полисахаридов в

моносахариды, они хорошо всасываются через кишечную стенку в кровь и разносятся по организму для выполнения своих функций.

Липиды - соединения, получающиеся из высших жирных кислот и глицерина. Например, стеарин получается в результате реакции между глицерином и стеариновой кислотой: C3H5(OH)3 + 3C17H35COOH -> (C17H35COO)3C3H5 + 3H2O

В составе ряда липидов кроме этих компонентов встречаются фосфорная кислота, азотистые основания, или углеводы. В экстракте, полученном при обработке животных или растительных тканей органическими растворителями, присутствуют обычно высшие

148

и полициклические спирты, жирорастворимые витамины, которые некоторые авторы также относят к классу липидов.

Липиды могут быть классифицированы следующим образом:

1.Нейтральные жиры и свободные жирные кислоты

2.Фосфолипиды

3.Гликолипиды

4.Стероиды

5.Воска

6.Терпены

Функции этого класса соединений важны и разнообразны.

Прежде всего, липиды в виде комплекса с белками являются структурными элементами мембран клеток и клеточных органелл. В связи с этим они определяют транспорт веществ в клетки и участвуют в ряде других процессов, связанных с функционированием мембран.

Липиды служат также энергетическим материалом для организма. При окислении 1 г жира выделяется 39 кДж энергии, т. е. В 2 раза больше, чем при расщеплении 1 г углеводов. Одновременно липиды являются запасными веществами, в форме которых депонируется метаболическое топливо. Определенное исключение в этом отношении составляют бактерии: у большинства из них накопление энергии осуществляется в нелипидной форме (гликоген) и только 9у некоторых видов - в форме поли-3- гидроксимасляной кислоты.

В связи с хорошо выраженными термоизоляционными свойствами липиды сохраняют тепло в организме, особенно у морских и полярных животных, выполняя тем самым защитную функцию. В виде жировой прокладки предохраняют тело и органы животных от механического повреждения, служат жировой смазкой для кожи. Восковой

коферменты - переносчики. От свойств и структуры мембранных липидов во многом

существенное влияние на функционирование нервной системы.

Липиды - важная составная часть пищи. Взрослому человеку требуется от 70 до 145 г жира в сутки в зависимости от трудовой деятельности, пола, климатических условий. Причем необходимы как животные, так и растительные жиры. Липиды являются высокоэнергетическими веществами, поэтому за их счет удовлетворяется 25-30% потребности человеческого организма в энергетическом материале. Кроме того, в составе животных жиров в организм поступают жирорастворимые витамины А, Д, К, Е, растительные жиры богаты непредельными жирными кислотами (витамин Р), являющимися предшественниками простагландинов, исходным материалом для синтеза организмом фосфолипидов и других веществ.

Белки - наиболее сложные химические соединения в клетках. Они построены из аминокислот. Молекула белка, по сути, неопределенно длинная цепь аминокислот.

149

В организме животных белков содержится до 40-50 % и более на сухую массу, у растений до 20-35%.Разнообразны и очень важны функции белков.

Строительная, структурная функция. Белки образуют основу протоплазмы любой живой клетки, в комплексе с липидами они являются основным структурным материалом всех клеточных мембран, всех органелл.

Каталитическая функция. Практически все биохимические реакции катализируются белками-ферментами.

Двигательная функция. Любые формы движения в живой природе (работа мышц, движение ресничек и жгутиков у простейших) осуществляются белковыми структурами клеток.

Транспортная функция. Белок крови гемоглобин транспортирует кислород от легких к тканям и органам. Есть белки крови, транспортирующие липиды, железо, стероидные гормоны. Перенос многих веществ через клеточные мембраны осуществляют особые белки-переносчики.

Защитная функция. Важнейшие факторы иммунитета - антитела и система

кожи, предохраняющей тело от многих внешних воздействий, составляет белок коллаген. Гормональная функция. Ряд гормонов по своему строению относится к Опорная функция. Сухожилия, суставные сочленения, кости скелета образованы

в значительной степени белками.

Запасная функция. Белки способны образовывать запасные отложения (овальбумин яиц, казеин молока, многие белки семян).

Белки имеют большое народнохозяйственное значение. Белки являются основными компонентами пищи человека и животных. Многие заболевания связаны с хроническим белковым голоданием. Технология многих производств основана на переработке белков, Изменении их свойств.

Строение белковой молекулы. Аминокислоты соединяются друг с другом ковалентной пептидной или амидной связью. Образование ее происходит за счет

молекулы это порядок чередования аминокислот в полипептидной цепи. Вторичная структура - это упорядоченное пространственное расположение отдельных участков полипептидной цепи, она образуется за счет замыкания водородных связей между пептидными группами. Третичная структура описывает пространственную укладку всей молекулы белка. В поддержании третичной структуры белка, ее закреплении принимают

связей между ними.

Все белки принято делить на две группы: простые, или протеины (состоят только из аминокислот), и сложные (в их молекуле помимо белковой части содержится и небелковая, простетическая): хромопротеины, липопротеины, нуклеопротеины и т. д.

150