Вторая тема

1. Эксперимент Гриффитса был выполнен в 1928 году с целью разработки вакцины от пневмонии. Гриффитс работал с двумя штаммами бактерии Streptococcus pneumoniae. Штамм, колонии которого были гладкими (S штамм), имел полисахаридную капсулу и был вирулентным, вызывая у подопытных мышей пневмонию. Капсула предохраняла бактерии от воздействия иммунной системы больного. Колонии второго штамма имели неровную поверхность (R штамм) и не вызывали пневмонию, поскольку не имели капсулы, и после введении в кровоток мыши бактерии погибали. Бактерии S штамма, убитые нагреванием, также не вызывали заболевания. Но когда Гриффитс смешивал убитый S штамм с живым R штаммом и вводил смесь мышам, животные погибали.

Когда Гриффитс выделил болезнетворные бактерии из погибших мышей, он обнаружил, что R штамм приобрел капсулу, то есть превратился в вирулентный S штамм и сохранял новоприобретенный фенотип во многих поколениях, то есть передавал его по наследству. Гриффитс предположил, что превращение осуществил некий «трансформирующий фактор», который R штамм получил от убитых бактерий S штамма.

Эксперимент Эвери был выполнен в 1944 году и явился кульминацией исследований, начатых Гриффитсом. В ходе эксперимента пневмококки, образующие гладкие колонии, были убиты нагреванием, и из них был извлечён компонент, растворимый в водно-солевом растворе. Белки были осаждены хлороформом, а полисахаридные капсулы, обусловливающие антигенные свойства бактерий, гидролизованы специфичным ферментом.

Химический анализ показал, что соотношение углерода, водорода, азота и фосфора в полученном осадке соответствует соотношению этих же элементов в молекуле ДНК. Для подтверждения того, что действующим началом трансформации является именно ДНК, но не РНК, белки или другие компоненты клетки, Эвери с сотрудниками обработали смесь трипсином, химотрипсином, рибонуклеазой, но эта обработка никак не влияла на трансформирующие свойства. Лишь обработка ДНКазой приводила к разрушению трансформирующего начала. Таким образом было установлено, что действующим началом бактериальной трансформации является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).

2. Нуклеотид ДНК состоит из трёх частей: остатка фосфорной кислоты, углевода-дезоксирибозы и азотистого основания (аденин, цитозин, гуанин или тимин). Соединяются между собой они через остаток фосфорной кислоты на 5' конце и гидроксогруппу на 3' конце, поэтомуговорят о 3'-5' строении.

3. Трехмерная модель пространственного строения двухцепочечной ДНК была описана в 1953 г. Дж. Уотсоном и Френсисом Криком. Согласно этой модели молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, которые образуют правую спираль (винтовую линию) относительно одной и той же оси. Направление цепей взаимно противоположное. Структура ДНК – полимер, структурной единицей которого является нуклеотид.

Двойная спираль ДНК правосторонняя. Десять пар оснований (их протяжность равна 3,4 нм) составляют полный оборот 360º, следовательно, каждая пара оснований повернута на 36º вокруг спирали относительно следующей пары. Сахарофосфатный остов располагается по периферии двойной спирали, а азотистые основания находятся внутри и их плоскости перпендикулярны оси спирали. Между основаниями образуются специфические водородные связи. Аденин всегда образует водородные связи с тимином, а гуанин с цитозином. Такая закономерность называется комплементарностью. Комплементарность – это определенная последовательностей оснований в противоположных цепях ДНК. Данная закономерность очень важна для репликации ДНК.

4. Свойства ДНК (в скобках указаны функции, обеспечиваемые даннм свойством):

- генетический код (хранение наследственной информации);

- репликация, или ауторепродукция (передача её);

- реализация её (транскрипция).

5. Репликон – это фрагмент ДНК от одной точки начала репликации до другой, является единицей репликации.

С помощью фермента геликазы двойная спираль ДНК расплетается. Образовавшиеся при этом одноцепочечные участки связываются специальными дестабилизирующими белками. Молекулы этих белков выстраиваются вдоль полинуклеотидных цепей, растягивая их остов и делая азотистые основания доступными для связывания с комплементарными нуклеотидами, находящимися в нуклеоплазме. Области расхождения полинуклеотидных цепей в зонах репликации называют репликационными вилками.

Разделение спирально закрученных цепей родительской ДНК геликазой вызывает супернапряжение перед репликационной вилкой. Для его снятия топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК, что даёт ей возможность свободно вращаться вокруг второй.

В каждой репликационной вилке при участии фермента ДНК – полимеразы синтезируются ДНК двух новых дочерних молекул. Синтез этот осуществляется на основе РНК-праймера, синтезируемого РНК-праймазой. ДНК-полимераза присоединяет к свободному 3' концу праймера нуклеотиды. В процессе синтеза репликационная вилка движется вдоль материнской спирали ДНК, захватывая все новые зоны. Из двух дочерних цепей одна реплицируется непрерывно, т.к. ДНК-полимераза может осуществлять синтез только по направлению от 5' конца праймера к 3' концу, и её синтез идет быстрее. Эту цепь называют лидирующей. Синтез другой цепи идет медленнее, так как она собирается из отдельных фрагментов Оказаки. Фрагменты образуются с помощью РНК-праймеров, а синтез осуществляется по типу шитья «назад иголкой». Затем ДНК-лигаза вырезает из отстающей цепи РНК-праймеры и сшивает между собой фрагменты ДНК.

Конечным результатом процесса редупликации является образование двух молекул ДНК, нуклеотидная последовательность которых идентична таковой в материнской двойной спирали ДНК. В результате вновь синтезированная молекула ДНК воспроизводит всю специфику исходной молекулы.

6. Генетический код – это способ записи генетической информации о последовательности аминокислот в белке с помощью нуклеотидов ДНК. Его строение открыл Нирбер.

В изучении генетического кода и его свойств следует особо выделить Георгия Гамова, опубликовавшего в 1954 году статью, доказывающую, что «при сочетании нуклеотидов тройками получается 64 различные комбинации, чего вполне достаточно для записи наследственной информации».

Свойства генетического кода:

- триплетность;

- неперекрываемость;

- вырожденность;

- непрерывность;

- коллинеарность;

- универсальность;

- линейность;

- однозначность.

7. Ген – участок молекулы ДНК, кодирующий последовательность аминокислот в полипептиде или последовательность нуклеотидов в молекуле тРНК или рРНК.

Свойства гена:

- линейность;

- дискретность (несмешиваемость генов);

- специфичность (каждый ген кодирует свой признак);

- способность к мутации;

- способность к обратной мутации (невозможна при делеции – физическом выпадении участка);

- способность к кроссинговеру как внутри, так и между генами;

- контролирует последовательность аминокислот в полипептиде.

8. У эукариот объем наследственного материала значительно больше.

В отличие от прокариот в эукариотических клетках одновременно активно транскрибируется от 1 до 10% ДНК. Состав транскрибируемых последовательностей и их количество зависят от типа клетки и стадии онтогенеза. Значительная часть нуклеотидных последовательностей у эукариот не транскрибируется вообще — молчащая ДНК.

Большой объем наследственного материала эукариот объясняется существованием в нем помимо уникальных также умеренно и высоко повторяющихся последовательностей. Высоко повторяющиеся последовательности ДНК располагаются в основном в гетерохроматине, окружающем центромерные участки. Они не транскрибируются. Умеренные повторы распределены по всему геному и транскрибируются в РНК. К ним относятся гены, контролирующие синтез гистонов, тРНК, рРНК и некоторые другие. Остальная часть генома представлена уникальными нуклеотидными последовательностями.

Избыточность генома эукариот объясняется также экзон-интронной организацией большинства эукариотических генов, при которой значительная часть транскрибированной РНК удаляется в ходе следующего за синтезом процессинга и не используется для кодирования аминокислотных последовательностей.

9. Классы нуклеотидных последовательностей в ДНК эукариот:

- уникальные последовательности – практически не повторяются, содержат информацию об уникальных признаках данного организма или же являются неинформативными;

- умеренно повторяющиеся последовательности – представлены 10-1000 копиями, к ним относятся некоторые структурные гены, например кодирующие последовательность аминокислот в молекулах гистонов или нуклеотидов в рРНК и тРНК;

- высокоповторяющиеся последовательности (более 1000 повторов).

10. Уровни организации генома эукариот:

- генный уровень – представлен совокупностью генов;

- хромосомный – характеризуется особенностями морфологии и функций хромосом;

- геномный – совокупность всей генетической информации данного организма.

11. Хромосомы состоят из ДНК и белков, образующих нуклеопротеиновый комплекс. Все хромосомные белки подразделяются на две группы: гистоновые и негистоновые. Гистоновые белки представлены пятью фракциями: Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4. Последние четыре фракции при компактизации формируют нуклеосому, причём каждая фракция представлена двумя молекулами, т.е. в сумме нуклеосома состоит из 8 молекул. Гистоновые белки плотно прикрепляются к молекулам ДНК и препятсятвуют считыванию заложенной в них информации, выполняя тем самым регуляторную функцию. Кроме того, гистоновые белки выполняют структурную функцию, оеспечивая пространственную организацию ДНК.

12. Уровни упаковки наследственного материала эукариот:

- нуклеосомная нить (обеспечивается четырьмя видами нуклеосомных гистонов, образующих напоминающие по форме шайбу коры; молекула ДНК спирально накручивается на них; в основе такой структуры лежит нить, представляющая собой цепочку повторяющихся единиц – нуклеосом, состоящих из кора и прилегающего к нему отрезка молекулы ДНК);

- хроматиновая фибрилла (обеспечивается гистонами Н1, которые соединяются с линкерной, т.е. свободной от контакта с белковыми телами, ДНК и двумя соседними белковыми телами, сближает их друг с другом; получается более плотная структура, построенная по типу соленоида);

- интерфазная хромонема (хроматиновая фибрилла укладывается в петли, в формировании которых участвуют негистоновые белки);

- метафазная хромосома (происходит суперспирализация хроматина, в результате чего отдельные хромосомы становятся различимыми).

13. На стадии метафазы митоза хромосомы состоят из двух продольных копий, которые называются сестринскими хроматидами и которые образуются при репликации. У метафазных хромосом сестринские хроматиды соединены в районе первичной перетяжки, называемой центромерой. Центромера отвечает за расхождение сестринских хроматид в дочерние клетки при делении. Центромера делит хромосомы на две части, называемые плечами. У большинства видов короткое плечо хромосомы обозначают буквой p, длинное плечо — буквой q. Длина хромосомы и положение центромеры являются основными морфологическими признаками метафазных хромосом.

В зависимости от расположения центромеры различают три типа строения хромосом:

- акроцентрические хромосомы, у которых центромера находится практически на конце, и второе плечо настолько мало, что его может быть не видно на цитологических препаратах;

- субметацентрические хромосомы с плечами неравной длины;

- метацентрические хромосомы, у которых центромера расположена посередине или почти посередине.

Дополнительным морфологическим признаком некоторых хромосом является так называемая вторичная перетяжка. Вторичные перетяжки бывают различной длины и могут располагаться в различных точках по длине хромосомы. Вторичные перетяжки отделяют от основной хромосомы так называемые спутники, содержащие многократные повторы генов, кодирующих рибосомные РНК.

14. В зависимости от состояния хроматина выделяют эухроматиновые участки хромосом, отличающиеся меньшей плотностью упаковки в неделящихся клетках и потенциально транскрибируемые, и гетерохроматиновые участки, характеризующиеся компактной организацией и генетической инертностью. В их пределах транскрипции биологической информации не происходит.

Различают конститутивный (структурный) и факультативный гетерохроматин.

Конститутивный гетерохроматин содержится в околоцентромерных и теломерных участках всех хромосом, а также на протяжении некоторых внутренних фрагментов отдельных хромосом. Он образован только нетранскрибируемой ДНК. Вероятно, его роль заключается в поддержании общей структуры ядра, прикреплении хроматина к ядерной оболочке, взаимном узнавании гомологичных хромосом в мейозе, разделении соседних структурных генов, участии в процессах регуляции их активности.

Примером факультативного гетерохроматина служит тельце полового хроматина, образуемое в норме в клетках организмов гомогаметного пола (у человека гомогаметным является женский пол) одной из двух Х-хромосом. Гены этой хромосомы не транскрибируются. Образование факультативного гетерохроматина за счет генетического материала других хромосом сопровождает процесс клеточной дифференцировки и служит механизмом выключения из активной функции групп генов, транскрипция которых не требуется в клетках данной специализации. В связи с этим рисунок хроматина ядер клеток из разных тканей и органов на гистологических препаратах различается. Примером может служить гетерохроматизация хроматина в ядрах зрелых эритроцитов птиц.

15. Кариотип – совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида (видовой кариотип), данного организма (индивидуальный кариотип) или линии (клона) клеток.

В кариотипе человека 44 аутосомы (двойной набор) - 22 пары гомологичных хромосом и одна пара половых хромосом — XX у женщин и ХУ у мужчин. По форме и размерам все аутосомы-гомологи делятся на 7 групп, обозначаемых латинскими буквами от А до G.

16. Денверская классификация хромосом человека (1960 год).

Согласно этой системе, 22 пары аутосом были перенумерованы от 1 до 22-й в порядке уменьшения их длины, пара половых хромосом обозначена символами Х и У. Кариотип мужчины - ХУ, женщины - ХХ. 22 пары аутосом разделены на семь групп, обозначаемых буквами от А до G. Каждая группа хромосом характеризуется следующими особенностями:

Парижская классификация хромосом человека (1971 год).

На ней была согласована система символов для более краткого и однозначного обозначения кариотипов.

При описании кариотипа:

• указывается общее число хромосом и набор половых хромосом, между ними ставится запятая (46, XX; 46, XY);

• отмечается какая хромосома лишняя или какой не хватает (это ука-зывается ее номером 5, 6 и др., или буквами данной группы А, В и др.); знаком «+» указывают на увеличение количества хромосом, знаком «-» указывают на отсутствие данной хромосомы 47, XY,+ 21;

• плечо хромосомы, в котором произошло изменение (удлинение короткого плеча указывается символом (р+); укорочение (р-); удлинение длинного плеча указывается символом (q+); укорочение (q-);

• символы перестроек (транслокация обозначается t, а делеция — del) помещают перед номерами вовлеченных хромосом, а перестроечные хромосомы заключают в скобки. Наличие двух структурно-аномальных хромосом обозначается точкой с запятой (;) или нормальной дробью (15/21).