Осмолярность

Важной характеристикой среды является ее осмолярность, определяемая

концентрацией и константами диссоциации ее компонентов. Обычно осмолярность

равняется 285 мОсм/кг воды и соответствует таковой крови. Ооциты и эмбрионы

млекопитающих обычно культивируются в открытых системах с максимально

достижимой влажностью (80 - 90% в зависимости от модели CO₂

-инкубатора), что предотвращает сильные колебания осмолярности в процессе

культивирования.

Качество воды

Основой любой культуральной среды является вода, качество которой во многом

определяет успех культи­вирования. Для питательных сред используется вода,

полученная после двойной дистилляции, ультрафиль­трации либо деионизации. При

этом необходимо со­блюдение полной стерильности в процессе ее приготов­ления

и хранения. Эндотоксины, выделяемые бактери­ями, оставшимися в среде после ее

ультрафильтрации, могут оказать токсическое воздействие на эмбрионы.To же

может произойти и при попадании бакте­рий в среду в процессе хранения.

Ионный состав

Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды для

культивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли со­бой

модификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержания

жизни клеток – Na⁺, К⁺, Са²⁺, Mg²⁺,

и , растворенные в

бикарбонатном буфере (НCO₃). Также добавлялись антибио­тики для

предотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина или

сыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка использует­ся бычий или

человеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческая

сыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческая

трубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Более

сложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и были

разработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивирования

эмб­рионов различных видов млекопитающих.

Энергетическими субстратами для ооцитов и эмб­рионов млекопитающих в

культуральной среде обыч­но служат пируват, лактат и глюкоза, причем

усвое­ние глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии нескольких

клеточных делений, а до это­го предпочтительным источником энергии служит

пи­руват.

Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется их

присутствием в жидкости яйце­водов многих видов млекопитающих. Было показано,

что добавление глутамина в культуральную среду ока­зывает положительное

влияние на развитие эмбрио­нов многих видов млекопитающих. Однако при

введе­нии в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаются

стабильны в условиях культивирова­ния – при температуре 37С многие из них

разруша­ются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладает

токсическим эффектом.

Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработана

среда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержит

ами­нокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев – даже

жирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в раз­личных

лабораториях. При том, что роль многих ком­понентов сложных сред до сих пор

не была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты.

CO₂-ИНКУБАТОР

Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO

₃в воздухе при тем­пературе 37±0,1 °С и влажности 80 – 90%. Эти условия

соблюдаются при использовании CO₃-инкубаторов, поддерживающих

необходимую температуру, влаж­ность и уровень CO₂ в камере.

Последний параметр поддерживается посредством подачи углекислого газа из

баллона, где он находится в сжиженном состоянии, и воздуха из окружающей среды.

Углекислый газ для культивирования должен соответствовать медицин­ским

стандартам по чистоте. В некоторых клиниках применяется готовая газовая смесь,

содержащая угле­кислый газ, азот и кислород в нужной пропорции.

Влажность в камере CO₃-инкубаторов поддержива­ется постоянным

испарением воды со дна камеры ли­бо из специального лотка. Также в некоторых

совре­менных инкубаторах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух,

позволяющая автоматиче­ски поддерживать влажность в камере до 90%.

В связи с высоким уровнем влажности в инкубато­рах высок риск роста бактерий

и плесени, поэтому не­обходима регулярная очистка всех поверхностей ка­меры.

Как правило, для этой цели используют 70% этиловый спирт, однако делать это

надо с большой ос­торожностью, поскольку известно негативное влияние

этилового спирта на ооциты и ранние эмбрионы.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ООЦИТОВ

Во время трансвагинальной пункции (ТВП) преовуляторных фолликулов вместе с

фоллику­лярной жидкостью в пробирки попадают комплексы ооцит-cumulus. Cumulus

oophorus (яйценосный буго­рок) представляет собой часть фолликулярного

эпите­лия, непосредственно контактирующую с ооцитом в процессе

фолликулогенеза. Помимо прочего фоллику­лярная жидкость содержит фибриноген,

что приводит к образованию кровяных сгустков уже через несколь­ко минут после

аспирации. Если ооцит находится в таком сгустке, его будет достаточно сложно

обнару­жить и впоследствии отмыть. Для преодоления этой проблемы используются

два основных подхода:

1. Фолликулярную жидкость просматривают под ми­кроскопом сразу после

аспирации и найденные ооци­ты незамедлительно помещают в среду для отмывки.

2. Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, содержащие среду с

гепарином, предотвращаю­щую образование кровяных сгустков.

Как правило, в большинстве лабораторий руковод­ствуются вторым подходом. При

этом используется гепарин в концентрации 50 МЕ/мл. Этот раствор в объеме 1 мл

добавляется в пробирки объемом 8 - 10 мл, что дает конечную концентрацию

гепарина в фолликулярной жидкости 5 - 8 МЕ/мл. Известно, что гепарин не

оказывает влияния на оплодотворение и последующее развитие эмбриона.

Комплексы ооцит-cumulus перед помещением в культуральную среду обязательно

отмывают в специальной среде.

После того как аспирированная фолликулярная жидкость попадает в

эмбриологическую лабораторию, она незамедлительно просматривается на

присутствие комплексов ооцит-cumulus. Для этого содержимое пробирок

переливается в чашки Петри диаметром 9 см и исследуется под стереомикроскопом

или инвер­тированным микроскопом при небольшом увеличе­нии. Как правило,

комплексы ооцит-cumulus видны и невооруженным глазом как блестящие слизистые

комки или тяжи диаметром 0,5 – 1 см.

Найденные ооциты помещаются в среду для отмыв­ки, содержащую HEPES-буфер,

позволяющий мани­пулировать с ооцитами на воздухе без риска измене­ния рН в

щелочную сторону (такие среды производят­ся большинством фирм,

специализирующихся на про­изводстве сред для ЭКО), затем отмываются в

культуральной среде и помещаются в лунку 4-луночной чашки либо в специальную

чашку для ЭКО, где в дальнейшем будет проводиться оплодотворение ооци­тов и

культивирование эмбрионов.

Также допускается культивирование в небольших (5 – 10 мкл) каплях среды,

покрытых слоем мине­рального масла, предварительно эквилиброванного с

культуральной средой в присутствии 5% С0₂. Преиму­ществами

культивирования под маслом являются: препятствование попаданию в культуральную

среду мик­роорганизмов и частичек пыли, возможность культи­вирования в

небольших каплях среды, что важно при оплодотворении спермой с небольшой

концентрацией активных сперматозоидов, а также замедление испаре­ния воды и

выхода CO₂ из среды вне инкубатора. Одна­ко, если капли со средой

под маслом слишком долго находились вне инкубатора, возвращение к исходному

равновесию влажности и концентрации CO₂ займет гораздо больше

времени, чем в отсутствие масла.

Манипуляции с ооцитами проводят с помощью от­тянутых стерильных пастеровских

пипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклян­ных

(пластиковых) капилляров, присоединенных к микроаспиратору. Существуют и

другие способы ма­нипуляций с ооцитами и эмбрионами – выбор зави­сит от

опыта и желания эмбриолога.

Сразу после помещения ооцитов в культуральную среду необходимо оценить

количество, качество и сте­пень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus.

Классификация комплексов ооцит-cumulus,

применяемая в клинике Bourn Hall, Кембридж

	Ооцит	Характеристика
1	Очень незрелый	Клетки cumulus и corona radiata плотно упакованы во­круг ооцита. Иногда можно увидеть ядро ооцита - за­родышевый пузырек. Такой ооцит находится на стадии профазы первого деления мейоза (GV-germinal vesicle stage), на которой происходит блок мейоза в процессе оогенеза. Полярное тельце еще не сформи­ровалось
2	Незрелый	Клетки corona radiata все еще плотно примыкают к ооциту, cumulus незначительно увеличился. Такой ооцит обычно находится на стадии метафазы первого деления мейоза (М I), блок мейоза уже снят, однако формирование полярного тельца пока не произошло
3	Преовуляторный	Клетки corona radiala расходятся лучами от ооцита, cumulus разросшийся, но имеет клеточную структуру. Ооцит находится на стадии метафазы второго деления мейоза (М II), Полярное тельце уже сформировано
4	Перезрелый	Присутствует небольшое количество клеток corona radiata, уже не примыкающих плотно к ооциту, который хорошо просматривается. Cumulus разросшийся, но все еще имеет клеточную структуру. Полярное тельце обычно хорошо видно
5	Лютеинизированный	Вокруг ооцита клетки cumulus образуют скопления (комки), остальной cumulus представляет собой желе­образную массу с небольшим количеством клеток
6	Дегенеративный	Несколько клеток гранупезы окружают ооцит, cumulus отсутствует или очень маленький. Ооцит обычно темноокрашен

Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцит-cumulus, как

правило, субъективна и часто не отвечает истинному состоянию ооцита.

Асинхронность в созревании ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus достаточно

часто встречается в циклах стимуляции суперовуляции при ЭКО. Однако более

точное определение степени зрелости (если клетки co­rona radiata и cumulus

удаляют ферментативно или механически) может привести к травматизации ооци­та

и увеличению риска полиспермии при оплодотворении.

На рис.2 представлены данные по распределению ооцитов, полученных в ходе

стимуляции суперовуляции, по степени зрелости. Оценка производилась после

удаления клеток cumu­lus.

Рис.2. Распределение ооцитов по степени зрелости ядра на момент ТВП: GV – стадия зародышевого пузырька (germinal vesic le) – очень незрелый ооцит; М I – стадия метафазы первого деления мейоза – незрелый ооцит; М II –стадия метафазы второго деления мейоза – зрелый ооцит; ATR –дегенератив­ный ооцит (См. рис. 3)

Рис.3. Ооцитарно-фолликулярные комплексы.

а – незрелый; б – зрелый; в – пере­зревающий. Микрофотографии живых объектов

в фазовом контрасте.

ОБРАБОТКА СПЕРМЫ ПЕРЕД

ОПЛОДОТВОРЕНИЕМ ООЦИТОВ in vitro

Эякулят для ЭКО получают путем мастурбации в стерильный контейнер. После

полного разжижения спермы, происходящего при комнатной температуре через 30 -

60 мин, приступают к ее обработке. Предва­рительно необходимо провести анализ

концентрации сперматозоидов, их подвижности и морфологических характеристик

по стандартной методике ВОЗ.

Перед тем как добавлять сперму в культуральную среду с ооцитами, необходимо

ее обработать в целях удаления семенной плазмы и получения максимально

полноценной фракции прогрессивно подвижных спер­матозоидов. На практике

применяются два основных метода обработки спермы - центрифугирование-

фло­тация (процедура swim-up) и градиентное центрифуги­рование.

При использовании методики swim-up 1 – 2 мл спер­мы помещают в коническую 10 –

15-миллиметровую пробирку, добавляют 5 - 10 мл среды для отмывки

* и центрифугируют 5 – 10 мин при ускорении 1200 g. За­тем супернатант

удаляют, осадок ресуспендируют в 2 – 3 мл среды и вновь центрифугируют. После

удаления супернатанта 1 – 2 мл свежей среды осторожно наслаи­вают на осадок,

пробирку помещают в CO₂-инкубатор при 37°С на 30 – 60 мин. В течение

этого времени по­движные сперматозоиды должны мигрировать в насло­енную среду,

оставив на дне пробирки неподвижные сперматозоиды, дебрис и иные клетки. Если

пробирки будут установлены наклонно, увеличится площадь контакта осадка со

средой и, соответственно, выход по­движных сперматозоидов. Для определения

кон­центрации и подвижности сперматозоидов в надосадочной жидкости берется

аликвота 10 или 50 мкл. Затем необходимое количество чистого супернатанта

исполь­зуется для инсеминации.

Важным шагом вперед в методике обработки спермы стало внедрение метода

центрифугирования в градиенте Перколла. Перколл пред­ставляет собой суспензию

силиконовых гранул 15 – 30 нм в диаметре, покрытых слоем поливинилпирролидона

(PVP), поскольку в чистом виде они токсичны для клеток. Особенностью Перколла

является очень низкая осмолярность – 25 мОсм/л, поэтому при раз­ведении в

среде до различных концентраций, соответ­ствующих различным плотностям (от

1,01 до 1,13 г/л), осмолярность растворов остается постоян­ной. Растворы

Перколла (40 и 90%) готовятся из 100% раствора, представляющего собой смесь 9

час­тей Перколла и 1 части 10-кратно концентрированной среды для отмывки.

Прерывистый градиент плотности достигается путем помещения 1,5 мл 40%-го

Перкол­ла на 1,5 мл 90%-го в конической пробирке; сверху аккуратно

наслаивается сперма (1 – 2 мл), и вся эта трехслойная колонка

центрифугируется 15 мин при ускорении 700 g. После центрифугирования в осадок

попадают только функционально нормальные сперма­тозоиды; неподвижные и

аномальные сперматозоиды, а также лейкоциты и другие клетки спермы

задержи­ваются на границе 40 и 90%-q фракций. Осадок отбирается пастеровской

пипеткой и два раза отмыва­ется в специальной среде, как и в случае

применения методики swim-up (см. выше).

Последний метод, по мнению многих авторов, явля­ется более предпочтительным,

сочетая в себе хорошую сепарацию и высокий выход фертильных сперматозо­идов.

Кроме того, описано и защитное действие Перколла: он не позволяет попасть в

осадок дефект­ным сперматозоидам, лейкоцитам и другим клеткам спермы,

производящим большое количество свобод­ных радикалов, способных повреждать

мембраны сперматозоидов. Таким образом, чем более благо­приятно соотношение

жизнеспособных сперматозои­дов и дефектных, тем меньше вероятность

поврежде­ний первых.

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ООЦИТОВ in vitro

Много споров и разночтений вызывает вопрос о времени введения сперматозоидов

в среду, где культи­вируются ооциты. Наиболее общепринятым считает­ся, что

между выделением первого полярного тельца ооцита (достижением стадии М II) и

добавлением спермы должно пройти около 4 ч, тогда способность такого ооцита к

оплодотворению и последующему дроблению будет максимальной.

Преовуляторный фолликул на момент аспирации (обычно 36 ч после введения

хорионического гонадотропина - ХГ, имитирующего пик эндогенного ЛГ в момент

овуляции при естественном цикле), как пра­вило, содержит ооцит на стадии М

II. В естественных условиях овуляция, а значит, и возможность оплодо­творения

наступает через 38 - 40 ч после пика ЛГ.

На практике преинкубация ооцитов перед инсеминацией составляет от 2 до 6 ч.

Данные по влиянию времени инкубации на оплодотворяемость ооцитов, дробление

эмбрионов и беременность разноречивы. По данным К. Yanagida с соавт.,

исследовавших такую за­висимость при инкубации ооцитов в течение 1 - 11 ч

пе­ред оплодотворением (применялся метод интрацитоплазматической

микроинъекции сперматозоида в яйцеклетку - ИКСИ), способность ооцитов к

оплодот­ворению, последующему дроблению и имплантации статистически

достоверно снижается при инкубации их более 9 ч. Достоверных различий при

инкубации в течение 1 - 9 ч не было обнаружено. В другом ис­следовании было

показано, что инкубация более 9 ч перед оплодотворением наиболее оптимальна

для по­следующего прохождения всех вышеуказанных про­цессов при ИКСИ;

исследователи предполагают, что это связано с дозреванием цитоплазмы ооцита,

необхо­димым для его активации при оплодотворении.

Важным моментом в обеих работах является то, что инкубация ооцитов

происходила в присутствии кле­ток cumulus и corona radiata. Известно, что

созрева­ние ооцита полностью зависит от окружающих клеток фолликулярного

эпителия, поставляющих в ооплазму РНК и белки, необходимые для развития

будущего организма до включения его собственного генома, а также белковые

факторы, отвечающие за процесс оп­лодотворения. Было показано, что дозревание

ооцитов in Ditro со стадии GV до стадии МII при интактном cumulus

происходило с большей вероятностью, при­чем последующее их оплодотворение и

дробление бы­ло лучше.

Несмотря на расхождение данных, большинство ав­торов считает, что

преинкубация обязательно необхо­дима, а ее оптимальная длительность

подбирается эм­пирически в каждой лаборатории. При этом окно оп­лодотворения

для зрелого ооцита достаточно широко, однако преждевременное оплодотворение

недозревших ооцитов может негативно повлиять на исход дробления и имплантации

эмбрионов.

Помимо фактора времени, в инсеминации важным является и количественный

фактор. Количество про­грессивно подвижных сперматозоидов обычно должно

составлять 50 - 100 тыс. на 1 мл среды (при культиви­ровании в относительно

большом объеме среды) либо на ооцит (при культивировании в микрокаплях под

минеральным маслом). Подбирая концентра­цию сперматозоидов при

оплодотворе­нии ооцитов in vitro, нужно иметь в виду, что при добавлении

менее 50 тыс. активно подвижных сперматозоидов на 1 мл частота оплодотворения

будет существенно снижена, а при использовании очень вы­соких концентраций

возникают побочные эффекты: полиспермия (проникновение более одного

спермато­зоида в ооцит при оплодотворении), снижение жизне­способности

полученных эмбрионов (за счет повреж­дения кислородными радикалами, при

попадании погибающих или мертвых сперматозоидов, либо воз­действия

избыточного количества литических акросомальных ферментов).

Однако это правило реализуется лишь в случае нор­мальной морфологии

сперматозоидов, при наличии необходимой концентрации активно подвижных

спер­матозоидов в эякуляте, отсутствии дефектов акросомальной реакции или

отсутствии больших концентра­ций антиспермальных антител в сперме (MAR-тест

менее 50%). При наличии этих и других отрицатель­ных факторов, а также при

неудаче оплодотворения в предыдущей попытке ЭКО концентрация сперматозо­идов

может быть повышена путем снижения объема среды культивирования

(культивирование в микро­каплях, соломках для криоконсервации,

микрокапил­лярах), однако это далеко не всегда приводит к жела­емым

результатам. Для облегчения проникнове­ния сперматозоида в ооцит клетки

cumulus и corona radiata могут быть удалены ферментативно и механи­чески,

однако это повышает риск полиспермии.