10.2 Изучение псевдомицелиальной структуры дрожжей.
Дрожжи родов Candida и Trichosporon наряду с круглыми и овальными клетками могут образовать длинные клетки псевдомицелия.
Препарат «раздавленная капля» не позволяет выявить наличия псевдомицелиальных структур у дрожжей, так как они достаточно хрупкие и быстро разрушаются. Поэтому для этих целей производят посев культур на пластинки с агаровой пленкой. Для этого на стерильное предметное стекло наносят тонкий слой агаризованной питательной среды типа Сабуро и помещают его на подставку на дно стерильной чашки Петри. Затем на тонкой пленке питательной среды делают посев штрихом изучаемой дрожжевой культуры. На штрих стерильным пинцетом помещают стерильное покровное стекло так, чтобы часть штриха осталась свободной. Также на дно чашки Петри опускают стерильный кусочек ваты, смоченный водой, для поддержания необходимой влажности и для предотвращения высыхания засеянной культуры. По истечении 6-7 дней инкубации засеянные предметные стекла микроскопируют в том месте, где расположено покровное стекло. При этом нарушения псевдомицелиалных структур не происходит (при их наличии).
Задание:
1. Подготовить к стерилизации: чашки Петри с подставками, кусочками ваты и предметными стеклами внутри (по 1 чашке на каждого студента), покровные стекла (по 1 на каждого студента), воду в пробирке для смачивания ваты в чашках.
2. Приготовить агаризованную ПС типа Сабуро (глюкоза – 4%, пептон – 1%, агар – 2%) для посева дрожжевых культур на предметные стекла.
3. Произвести посев штрихом дрожжевых культур на предметные стекла.
4. По окончании инкубирования на следующем занятии выявить наличие/отсутствие псевдомицелиальных структур у выросших дрожжей.
10.3 Определение сбраживающей способности дрожжей.
С целью выявления сбраживающей способности дрожжей производят высев исследуемых культур на жидкие питательные среды, содержащие не менее 2% глюкозы, находящиеся в пробирках со вкладышами (маленькие запаянные с одного конца трубочки) или в трубках Дунбара. Наличие сбраживающей способности по окончании 24-ой инкубации при комнатной температуре детектируют визуально по присутствию пузырька газа в запаянном конце трубки Дунбара или во вкладыше.
Задание:
1. Приготовить ПС типа Сабуро-бульон (глюкоза – 4%, пептон – 1%), заполнить ею трубки Дунбара или пробирки со вкладышами. Закрыть ватно-марлевыми пробками, простерилизовать.
2. Произвести посев изучаемых дрожжевых культур на жидкую ПС.
3. Определить наличие/отсутствие сбраживающей способность у изучаемых дрожжевых культур.
10.4 Количественный учёт микроорганизмов с помощью счётных камер.
В счётных камерах Горяева можно произвести подсчёт крупных микробных клеток – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий, спор грибов, некоторых бактерий. Счетная камера представляет собой толстостенное предметное стекло с нанесёнными на нём поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка (рис. 9, а). Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней (рис. 9, б). Эти площадки служат для притирания покровного стекла к средней площадке.
Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по-разному сгруппированных.
Сторона
квадрата (ABCD,
рис. 12, в) равна 1/20 мм, площадь –1/400 мм2,
высота – 1/10 мм объём– 1/4000 мм3
или
1/4000000 см3.
Большой квадрат ABCD,
состоит из 16 малых квадратиков.
Рис. 12. Счётная камера Горяева: а – вид сверху; б – вид сбоку (h – высота камеры),
в – вид при малом увеличении микроскопа.
Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновских колец.
Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом 8х и 40х.
Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах, учитывая все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях.
Находят среднее количество клеток в одном квадрате. Пересчёт на 1 см3 суспензии с учётом разведения производят по формуле:
N = (a · 1000) · K/(h · S),
где N – число клеток в 1 см3 суспензии; а – среднее число клеток в большом квадрате; h – глубина камеры, мм; S – площадь квадрата, мм2; К - разведение исходной суспензии; 1000 – коэффициент пересчёта мм3 в см3.
Задание:
1. Изучить устройство камеры Горяева, притереть покровное стекло до появления ньютоновских колец.
2. Определить титр дрожжевой суспензии прямым счетом в камере Горяева. Рассчитать количество дрожжей в суспензии.