Турбидостатный способ культивирования.
Турбидостат представляет собой самую простую из всех хорошо перемешиваемых систем непрерывного перемешиваемых систем непрерывного культивирования. Концентрация клеток при турбидостатном культивировании регулируется постоянной подстройкой скорости поступления питательных компонентов. В отличии от хемостата концентрацию биомассы в турбидостате выбирает оператор, а скорость разбавления и соответственно концентрация субстратов поддерживается таким образом, чтобы сохранялся заданный уровень биомассы.
Турбидостатное культивирование осуществляют обычно в тех случаях, когда лимитирующий фактор не известен или в лимитирующих количествах субстрата нет необходимости. Поэтому субстрат добавляется в ферментер в избытке. Избыток концентрации всех компонентов питательной среды делает работу турбидостата стабильной даже при удельной скорости роста культуры близкой к максимальной (µмах). Турбидостат позволяет регулировать систему в широких инервалах концентраций биомассы при скорости разбавления близкой к критической (Dкр). Именно в этих условиях химостат менее стабилен.
Скорость разбавления в турбидостате всегда равна удельной скорости роста:
D=
=
µ
при условии Х=constanta
В свою очередь, постоянство концентрации микробной биомассы удерживают регуляцией скорости потока, которую осуществляет не оператор, а автоматическая система. В большинстве случаев с этой целью прибегают к прямому оптическому измерению мутности биомассы, котороя зависит от концентрации клеток (Х).
Для этого ферментер оборудуют фотоэлектроколлориметром или аналогичным ему устройством, работающем по принципу светорассеявания. Если концентрация клеток остается на нужном уровне питательная среда подается с заданной скоростью, а при снижении концентрации клеток подача питательной среды прекращается. Именно этот принцип работы турбидостата обеспечивает его устойчивую работу даже при коэффициенте разбавления близком к критическому – на границе вымывания клеток.
Сигналом для подачи среды может быть не только оптическая плотность (мутность), но и любой параметр среды, поддающийся измерению электродом или другим устройством, переводящим величину измерительного параметра в величину электрического потенциала. Последний усиливается и приводит в действие работу насоса, подающего раствор или питательную среду.
Поскольку основные метаболические функции (поглощение бактериями кислорода, выделение CO2, изменение рН), тесно связанны со скоростью роста клеток и в конечном счете с удельной скоростью роста культуры, именно эти показатели чаще других используют как измеряемые переменные при регулировке потока среды.
Например, для процессов культивирования имеющих прямую связь между приростом биомассы и изменением значения рН среды, используется рН-статный способ управления скоростью потока среды. Скорость потока с помощью автоматических устройств уравнивается со скоростью изменения рН растущей популяции, а следовательно, и со скоростью роста культур. Это обеспечивает поддержание рН на заданном уровне, а скорость роста является максимальной в данных условиях. Изменяя условия, можно проследить за соответствующими изменениями максимальной скорости роста культур. В последнее время в эксплуатацию вводятся сложные комплексы ферментер-ЭВМ, обеспечивающие более высокий уровень использования турбидостатного способа непрерывного культивирования.
Как химостатное, так и турбидостатное культивирование имеют большое количество вариантов. Например, тот и другой способы могут осуществляться одностадийно и двустадийно. Одностадийное культивирование означает, что процесс ведется в одной емкости (в одном ферментере), а двухстадийное – в двух последовательных ферментерах.
Одностадийное химостатное культивирование применяется при необходимости воспроизвести любую скорость роста культур, кроме максимальной. Двухстадийное культивирование в двух последовательных ферментерах позволяет обеспечивать культуры максимальной скоростью роста и даже создать условия для ее превышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирвание при D< µмах , а во второй подается культура из первого и добавляется свежая питательная среда. При этом во втором ферментере происходит повышение скорости протока вплоть до превышения µмах , а вымывание не происходит, т.к. из первого ферментера непрерывно поступает культура.
Одностадийное турбидостатное культивирование используют для получения максимальной скорости роста. При двухстадийном культивировании можно воспроизвести во втором ферменте вторую фазу роста периодической культуры – вернее фазу роста, связанную с синтезом вторичного продукта метаболизма. В первом ферментере ведется выращивание культуры при большой скорости роста, что соответствует фазе логарифмического роста периодической культуры. Второй ферментер берется большего размера или с содержанием значительно большего количества питательной среды. Поэтому поступающая из первого ферментера культура оказывается в условиях замедленного роста, соответствующего скорости роста периодической культуры в фазу стационарного максимума. Именно эта скорость и является оптимальной для синтеза вторичного продукта.
При низких концентрациях субстрата и при низкой концентрации клеток можно возвратить в ферментер часть вытекающей из него биомассы, возврат повышает концентрацию и ускоряет процесс. Вариантов возврата биомассы может быть несколько. Сепарируют вытекающую культуру и сгущенную часть возвращают в ферментер. Устанавливают различные фильтрующие устройства, позволяющие вытекать культуральной жидкости, но задерживающие клетки. Известны и другие методы культивирования.
Отъемно-доливной метод. Среда подается в проточный ферментер порциями. Отъем культуры также производится порциями или происходит постоянный слив. Кривая концентрации клеток при данном способе приобретает вид гребенки.
Многократное выращивание без стерилизации. Пименяется в практике наращивания патогенных бактерий для получения вакцин или других биопрепаратов. Из ферментера после окончания цикла роста сливается не вся культура, а оставляется небольшая её часть. К ней добавляется стерильная среда и цикл наращивания биомассы повторяется. Так ведут несколько циклов.
Продленная периодическая культура или метод подпитки. К периодической культуре добавляют свежую питательную среду по мере её истощения. Культура продолжает свой быстрый рост, который идет с постоянной скоростью до полного исчерпания всех компонентов питания.
Диализное культивирование. Культивирование ведут в гильзе, не проницаемой для клеток, но пропускающей растворенные вещества. Гильза с культурой помещается в проточную питательную среду. Из среды поступают компоненты питания и в неё же выносятся продукты метаболизма. Таким путем получают сильно концентрируемую биомассу.