nano_book[1]

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

достаточно сильным иммунитетом, то ему ничего не стоит их вовремя распознать и уничтожить. Но возрастающее с каждым годом число онкологических заболеваний убедительно свиде тельствует, что человеку, ослабленному стрессами, отравленно му загрязненной средой обитания и вредными привычками, просто не хватает сил эффективно бороться с этими “хитрыми” врагами. То же пресловутое курение (и пассивное в том числе) повышает риск заболевания раком легких на 60%.

Недостаток знаний о причинах появления опухолей огра ничивает и возможности их лечения. Сегодня врачи еще не ле чат раковые клетки («не перевоспитывают» их), а просто стара ются убить, чтобы продлить жизнь всего организма. Для этого у онкологов есть набор проверенных методов: операция, химио терапия, лучевая терапия или их сочетание.

Операция направлена на то, чтобы удалить саму опухоль. Для этого часто приходится вырезать больные ткани полностью, что очень травматично для организма. Такой метод лечения на ран них стадиях часто оказывается эффективным, однако часть опу холевых клеток может остаться в организме, и оперативное лече ние дополняют лучевым или химиотерапевтическим.

Лучевая терапия основана на том, что опухолевые клетки более чувствительны к различным видам облучения, чем здоро вые ткани. Поэтому их убивают, облучая больной орган, напри мер, рентгеновскими лучами. Но в этом случае часто гибнут и здоровые клетки, а из за патогенного действия ионизирующего излучения на организм часто развивается лучевая болезнь.

Химиотерапевтическое лечение также основано на повы шенной чувствительности опухолевых клеток к различным хи мических препаратам. Химиотерапия достаточно эффективна, но она сильно повреждает все клетки организма, в т. ч. кост ный мозг – главный кроветворный орган и «склад запчастей» – стволовых клеток. Поэтому увеличивать дозу можно лишь до определенных пределов.

Итак, проблема всех современных методов лечения рака заключается в том, что лекарственные препараты действуют как на больные, так и на здоровые клетки, то есть не избира тельно. Сказывается также и проблема биоусвояемости препа ратов, которые приходится вводить в больной организм в боль ших количествах, чтобы победить болезнь не умением, а чис

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

лом. Вот почему от подобных «бомбардировок» возникает мно го побочных эффектов.

Поэтому сегодня учеными всего мира ведутся активные ра боты по адресной доставке лекарств, которые будут точно попа дать в цель, не повреждая других органов. Для этого пытаются создать некое “транспортное средство” для точной доставки ле карств в клетку, так как многие болезни (не только рак) зависят от нарушения внутриклеточных механизмов, повлиять на кото рые можно только доставив лекарство в клетку.

Поиск молекулярного транспорта начался в восьмидесятые годы, когда исследователи стали активно заниматься генной инженерией. В частности, группе российских ученых под руко водством Александра Соболева удалось разработать специаль ную макромолекулу транспортер, способную доставить лекар ство в дефектную клетку.

Опыты, которые ставила группа Соболева на раковых клет ках, показали, что эффективность лекарственного вещества, которое доставляется макромолекулой транспортером в ядро, при различных типах рака может возрастать в 250 1000 раз, а это значит, что во столько же раз можно снизить дозу препара та, чтобы вызвать нужный эффект.

Конструкция транспортера состоит из четырех функцио нальных модулей: лиганда, эндосомолитического модуля, сиг нала внутриядерной локализации и собственно носителя лека рства. На первом этапе работает лиганд – модуль, обеспечиваю щий обнаружение больной клетки (например, раковой), ее “молекулярное узнавание”. Он же отвечает и за поглощение всей конструкции клеткой. Второй модуль – эндосомолитичес* кий – разрывает эндосому, “пузырь”, образующийся вокруг транспортера при его втягивании внутрь клетки. Далее в игру вступает третий модуль, который позволяет транспортеру про никнуть через поры ядерной мембраны. И наконец, четвертый модуль, несущий лекарство, позволяет ему приступить к вы полнению основной задачи – уничтожению ядра.

Откуда взяли модули макромолекулы транспортера? Один из используемых лигандов был взят из человеческого гормона, обладающего высоким сродством к рецепторам соответствую щей клетки мишени, эндосомолитический модуль – из дифте рийного токсина, модуль внутриядерной доставки – из белка

324

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

обезьяньего вируса, носитель лекарства – из части гемоглоби ноподобного белка кишечной палочки. Далее с помощью ген но инженерных методов была создана единая работоспособная конструкция.

“Меняя программу модулей, мы можем получить макромо лекулы транспортеры для лечения любого типа рака. К приме ру, если для лечения какого то заболевания нужно доставить лекарство не в ядро, а в другую органеллу клетки, то будет заме нена программа модуля внутриклеточной локализации. Или меняется программа носителя в зависимости от лекарственно го средства, которое необходимо доставить”, – объясняет Александр Соболев.

Помимо чисто генно инженерных методов, ведутся разра ботки и в области применения различных наносистем для об наружения и уничтожения раковых клеток. В качестве примера можно привести идею создания антираковых наносистем не посредственно в опухолевой ткани.

Было установлено, что если в клеточную ткань ввести раст воры некоторых веществ, то наночастицы этих веществ заро дятся, вырастут и соберутся в агрегаты на клеточных структурах ткани. Наночастицы почти не влияют на функционирование клеток, но делают их чувствительными к действию внешнего акустического поля (ультразвук). Если после образования на ночастиц на них подействовать акустическими волнами, то они нагреются до 43°С за время, за которое клетки без наночастиц почти не изменят температуры.

Это позволило предположить, что если найти вещества, на ночастицы которых могут формироваться в раковых клетках со значительно большей вероятностью, чем в здоровой ткани, то раковые клетки можно будет селективно нагреть и убить. И та кие вещества были найдены. Были получены интересные ре зультаты действия одного из них (терофтала) на развитие рако вой опухоли у мышей. Стало очевидным, что сами по себе на ночастицы терофтала не влияют на развитие опухоли, а акусти ческое поле лишь слабо замедляет ее рост. Но если поле нало жить после образования наночастиц терофтала, причем всего на 10 минут, объем опухоли в течение недели уменьшается на 80%!

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Использование квантовых точек в качестве люминес цирующих маркеров

Медиков и биологов чрезвычайно интересует, как переме щаются в организме различные вещества (в частности, лекар ства). Отслеживание такого перемещения позволяет им опреде лить, как распределяются и усваиваются в организме новые препараты, то есть какова их биологическая усвояемость.

До недавнего времени для подобных исследований приме нялись различные красители, называемые маркерами, подме шиваемые к исследуемому веществу. Подкрашенные клетки бы ли хорошо видны в оптический микроскоп на фоне бесцветных клеток организма, что позволяло делать довольно точные выво ды об их локализации. Но органические красители, во первых, могут быть токсичными, а во вторых, для их обнаружения тре буется облучение светом лишь определенной частоты, посколь ку различные красители отражали различные частоты спектра. Следовательно, для одновременного исследования нескольких препаратов требовалось столько же источников света.

Данную проблему удалось решить с помощью нанотехноло гий, а точнее – квантовых точек, которые мы рассматривали в одной из предыдущих глав. Напоминаем, что квантовые точки

– это полупроводниковые кристаллы нанометрового размера, имеющие уникальные химические и физические свойства, не характерные для тех же веществ в макромасштабе. Учеными бы ли получены уникальные флуоресцентные квантовые точки, причем разного цвета. Эти точки дают намного более мощный отблеск света, чем традиционные красители, и обладают осо бым биоинертным покрытием, которое, с одной стороны, защи щает сами квантовые точки от «нападения» ферментов и других биологических молекул, а с другой – не дает возможности ток сичным веществам попасть в организм, что очень важно для ди агностики заболеваний. Кроме того, разные группы таких нано меток можно освещать одним общим источником.

Квантовые точки широко применяются в диагностических целях. В частности, их можно присоединять к биомолекулам типа антител, пептидов, белков или ДНК. А эти комплексы, в свою очередь, могут быть спроектированы так, чтобы обнару живать другие молекулы (например, типичные для поверхнос ти раковых клеток).

326

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

В одном из опытов квантовые точки селенида кадмия были соединены со специфическим антителом, реагирующим с по верхностью клеток раковой опухоли. Квантовые точки вводили в кровеносную систему мышей, которая разносила их по орга низму. Нанокристаллы попадали в опухоль и накапливались там (и практически нигде больше), в результате чего опухоль оказалась хорошо различимой визуально.

Применение квантовых точек может существенно расши рить диагностические возможности медицины. Ведь можно сконструировать сотни разновидностей квантовых точек, сое диняющихся в организме с различными биомолекулами или антигенами, и таким образом находить участки со специфичес ким сочетанием признаков заболевания.

Рис 199. Растворы квантовых точек выглядят как подкрашенная вода*

Дальнейшие планы исследователей еще заманчивее. Новые квантовые точки, соединенные с набором биомолекул, будут не только находить и показывать опухоли, но и осуществлять точ ную адресную доставку новых поколений лекарств.

Наносистемы и биотехнологии: подражая природе

В последнее время на стыке этих двух технологий появи лось новое направление – биомиметика (био жизнь, миметикаподобие). Живые организмы производят нанотехнологичес кие операции на протяжении 4.5 миллиардов лет. Живая клетка использует ДНК, РНК и большое количество белков, чтобы строить клеточные структуры нанометровых размеров. Почему бы нанотехнологам не воспользоваться природными примера ми для построения собственных наномашин?

* Перепечатано с http://ehf.uni oldenburg.de

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Сегодня биомиметические нанотехнологии находятся в за чаточном состоянии, но их развитие существенно ускорит соз дание наномашин.

Конструируя из белков

Живые организмы строят конструкции из белков, и инже неры думают, как это применить. Некоторые белки, например, могут формировать регулярные структуры в виде кристалличес ких решеток, которые затем можно использовать при констру ировании наномашин и наноэлектронных устройств.

Бактерии на своей поверхности формируют слои кристал лического белка толщиной в одну молекулу, называемые S*слои (от англ. single один), которые повторяются с шагом в 10 нм. Австрийские ученые решили использовать эти естественные «квантовые сверхрешетки» для построения искусственных бел ковых структур. Первое, что придумали исследователи – выг нать бактерию из S слоя и порвать его на “субъединицы”. Одна ко эти субъединицы перестраивались на кремниевых и металли ческих подложках, а также на других синтетических полимерах. Если теперь к S слою на подложке добавить специальные сен сорные молекулы, получится точный биосенсор. Используя ха рактерную для белков боязнь ультрафиолета, исследователи ис пользовали S слой в качестве фоторезиста в литографии.

Другие ученые решили сконструировать из белков и неор ганических соединений структуры, которых вообще не сущест вует в природе. Однако из за огромной сложности квантовых уравнений для белковых молекул даже современные супер компьютеры не могут рассчитать, как именно белки с опреде ленной последовательностью аминокислот будут собираться в трехмерные структуры (так называемая проблема фолдинга, или свертки белка). Они пошли другим путем, заставляя виру сы синтезировать разнообразные белки из случайной последо вательности аминокислот. Затем ученые попросту промыли оборудование и в нем остались только те белки, которые присо единились к подложке. Так можно создавать белки, образую щие новые структуры, соединяясь с разными материалами. Ос талось создать “библиотеку” вирусов, производящих белки ли пучки для золота, серебра, оксида цинка, арсенида галлия и др.

На основе таких белков, соединенных с неорганическими веществами, можно сконструировать ряд квантовых точек, ко

328

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

торые получают сегодня с помощью вакуумных технологий. Сборка квантовых точек с помощью гибридных белков может происходить при комнатной температуре и быть гораздо дешев ле. Такие белки могут пригодиться и при создании наномашин.

Рис 200. Фрагменты ДНК, кодирующие различные белки, внедряют в ДНК бактериофага, который синтезирует эти белки на своей поверхности. Вирус размножается, образуя длинные нити, покрытые металлом, которые можно использовать в наноэлектронике и наносистемах

Исследователи из МТИ обнаружили, что бактериофаги “собираются” в длинные нити. При этом их внешние белки могут соединяться с сульфидом цинка или сульфидом кадмия, образуя длинные (600 нм) электропроводящие нанонити диа метром 20 нм. При нагревании полученной структуры до 350°C бактериофаги выгорают, а тончайшая металлическая нить оста ется. Затем ее можно использовать, например, в наноэлектро нике. Использованные в этом опыте вирусы состоят всего из шести белков, два из которых соединяются с неорганикой. Ис следователи хотят продолжить эксперименты с более сложны ми по белковому составу вирусами, чтобы получить трехмерные проводящие структуры.

“Поделки” из молекул ДНК

В качестве стройматериала при создании наноструктур мо гут выступать не только белки, но и… молекулы ДНК. Эту идею развил Нэдриан Симэн, профессор химии из Нью йоркского университета. Он достиг того, что молекула ДНК образует дву мерные и трехмерные структуры. Сама по себе молекула ДНК слишком “мягкая” для того, чтобы сформировать жесткую

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

структуру. Но если соединить две молекулы, то полученная конструкция будет достаточно “жесткой”, подходящей для то го, чтобы создавать устойчивые структуры.

Самым ярким примером такого конструирования из ДНК является первый в мире “шагающий” наноробот, недавно соз данный учеными! Робот передвигается, используя оригиналь ный принцип: поочередно то присоединяет свои «ноги», состо ящие из фрагментов ДНК, к базовой молекуле ДНК, то отсое диняет их от нее, продвигаясь таким образом вперед.

Почему исследователи использовали именно молекулы ДНК? На это есть две причины. Первая – цепи ДНК легко сое диняются друг с другом, образуя комплементарные пары. Вто рая – исследователи надеются, что в дальнейшем можно будет создать более сложных ДНК роботов в больших количествах, используя репликативную инженерию живых клеток.

Наноробот состоит из двух “ног” молекул ДНК длиной в 36 нуклеотидов. Сверху “ног” расположена еще одна упругая часть ДНК, связывающая обе “ноги” вместе (см. рисунок). Ша гает робот по своеобразной “дороге” – еще одной базовой мо лекуле ДНК. “Ноги” присоединяются к комплементарным участкам на “дороге” при помощи свободных “якорных” цепей ДНК.

Рис 201. Принцип работы “шагающего наноробота” а) Две ДНК ноги (обозначено красным) присоединены к комплементарным участкам ДНК дороги (А и В) при помощи якорей (голубой и оранжевый); б) Свободная цепь ДНК присоединяется к правому якорю;

в) Свободная цепь убирает правый якорь, освобождая правую «ногу» от пары В; г) Якорная цепь пары С связывает свободную правую ногу;

д) Другая свободная ДНК цепь (светло голубая) убирает якорь от левой ноги, отсоединяя ее от “дороги”; е) Другая якорная цепь (серая) присоединяет якорную цепь к паре В;

330

ГЛАВА 6. Биотехнологии и наномедицина

Итак, правая и левая “ноги” робота имеют уникальную последовательность нуклеотидов, поэтому каждой необходим соответствующий комплементарный ей участок на ДНК доро ге – своеобразный “якорь”.

Для того чтобы затем отсоединить заякоренную “ногу” от «дороги», необходима еще одна свободная цепь ДНК.

“Якорь” имеет участок, который не присоединяется ни к «ноге», ни к “дороге”. Этот участок присоединяется к свобод ной ДНК, которая затем отбирает “якорь”у “ноги”. “Ноги”, свободные от якоря, соединяются со следующей комплемен тарной парой на “дороге”, двигая таким образом робота вперед. Повтор этой процедуры приводит к движению робота.

Робот шагает в специальной жидкости, названной “денату рационный буфер”, которая препятствует сворачиванию цепей ДНК. Чтобы робот мог долго двигаться, в жидкости находятся миллионы якорей и свободных ДНК, удаляющих «якоря». Для начала движения робота помещают на “дорогу” и добавляют в раствор якоря.

Следующим шагом исследователей будет добавление к ро боту “повозки”, чтобы он мог переносить различные вещества, например, атомы железа.

Мобильные ДНК роботы могут помочь в сборке более сложных наносистем: нанокомпьютеров, точных наноманипу ляторов и более сложных нанороботов. Также ДНК роботы, ос нащенные наноманипуляторами, смогут манипулировать от дельными молекулами и атомами, воплощая в жизнь основную задачу нанотехнологии.

Конечно, как и говорилось выше, это только первые пробы биомиметики в нанотехнологиях. Не следует забывать о том, что природные наномашины пока совершеннее и проще тех, которые планирует изготовить человек, поэтому исследователи изучат в первую очередь то, что предлагает нам природа.

РНК наномашины

Как недавно доказали исследователи из Университета Пэрдью, наномашины могут быть построены и с помощью са моорганизующихся РНК структур. Ученые научились строить из молекул РНК несколько различных самособирающихся “матриц” размерами от сотен нанометров до нескольких мик рон. При этом их структуру можно задавать заранее!

НАНОТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ВСЕХ

Самосборка идет в нанометровом масштабе, но конечные “продукты” в ряде опытов достигали микронных размеров. “Наша работа показала, что мы можем управлять структурой трехмерных матриц, полученных с помощью самосборки моле кул РНК. При этом мы можем делать матрицы различных раз меров и формы, – говорит Пейхуан Гу, профессор молекуляр ной вирологии. – В дальнейшем, из молекул РНК можно будет конструировать сложные наномашины”.

Оказалось, что вирус бактериофаг phi29 использует подоб ные конструкции из молекул РНК для своего вирального мото ра. При этом сам процесс работы мотора похож на работу дви гателя внутреннего сгорания автомобиля. Роль камеры сгора ния играет портал – образование внутри капсида (тела) вируса, занятое молекулами РНК и ротором. Мономеры РНК, подобно поршням, поочередно толкают центральный 6 сторонний ро тор, заставляя его вращаться. В центре ротора находится моле кула ДНК.

Рис 202. Работа вирального мотора

Сегодня ученые собирают из молекул РНК “кольца”, “тре угольники” и “стержни”. Эти структуры можно интегрировать с нанотранзисторами, нанопроводниками, нанотрубками, био сенсорами и другими уже существующими наноструктурами, чтобы получить сложные НЭМС системы. Возможно, их мож но будет использовать даже для медицинских нанороботов, поскольку молекулы РНК обладают высокой биосовмести мостью с человеческим организмом.

332