- •Общая микробиология
- •1. Предмет, задачи, разделы микробиологии, ее связь с другими науками.
- •2. Основные этапы развития микробиологии.
- •3. Классификация микроорганизмов. Различия между эукариотами, прокариотами и вирусами.
- •4. Классификация бактерий. Принципы современной систематики и номенклатуры, основные таксономические единицы. Понятие о виде, варианте, культуре, популяции, штамме.
- •5. Методы микроскопии. Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний.
- •6. Методы окраски микробов и их отдельных структур.
- •7. Морфология и химический состав бактерий. Протопласты. L – формы бактерий.
- •8. Ультраструктура бактерий.
- •9. Спорообразование у бактерий. Патогенные спорообразующие микробы.
- •10. Капсулы у бактерий. Методы их обнаружения.
- •11. Жгутики и включения у бактерий. Методы их обнаружения.
- •14. Рост и размножение бактерий. Кинетика размножения бактериальной популяции.
- •15. Морфология и ультраструктура риккетсий. Морфология и ультраструктура хламидий. Патогенные виды.
- •16. Морфология и ультраструктура спирохет. Классификация, патогенные виды. Методы выделения.
- •17. Морфология и ультраструктура микоплазм. Патогенные для человека виды.
- •18. Систематика и номенклатура вирусов. Принципы современной классификации вирусов.
- •19. Эволюция и происхождение вирусов. Основные отличия вирусов от бактерий.
- •20. Морфология, ультраструктура и химический состав вирусов. Функции основных химических компонентов вируса.
- •21. Репродукция вирусов. Основные фазы репродукции вирусов. Методы индикации вирусов в исследуемом материале.
- •22. Вирусологический метод диагностики. Методы культивирования вирусов.
- •23. Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.
- •24. Морфология, ультраструктура и химический состав фагов. Этапы репродукции фагов. Различия между вирулентными и умеренными фагами.
- •25. Распространение фагов в природе. Методы обнаружения и получения фагов. Практическое использование фагов.
- •26. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний.
- •27. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.
- •28. Ферменты бактерий, их классификация. Принципы конструирования питательных сред для изучения ферментов бактерий.
- •29. Основные принципы культивирования бактерий. Факторы, влияющие на рост и размножение бактерий. Культуральные свойства бактерий.
- •30. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.
- •31. Микрофлора почвы, воды, воздуха. Патогенные виды, сохраняющиеся во внешней среде и передающиеся через почву, воду, пищевые продукты, воздух.
- •32. Санитарно – показательные микроорганизмы. Коли – титр, коли – индекс, методы определения.
- •34. Взаимоотношения между микроорганизмами в ассоциациях. Микробы – антагонисты, их использование в производстве антибиотиков и других лечебных препаратов.
- •35. Влияние на микробы физических, химических и биологических факторов.
- •36. Стерилизация и дезинфекция. Методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.
- •38. Формы и механизмы наследственной изменчивости микроорганизмов. Мутации, репарации, их механизмы.
- •43. Генетика вирусов. Внутривидовой и межвидовой обмен генетическим материалом.
- •44. Основные группы антимикробных химиопрепаратов, применяемых в терапии и профилактики инфекционных болезней.
- •45. Антибиотики. Классификация. Механизмы действия антибактериальных препаратов на микробы.
22. Вирусологический метод диагностики. Методы культивирования вирусов.
Вирусологический метод включает культивирование вирусов, их индикацию и идентификацию. Материалами для вирусологического исследования могут быть кровь, различные секреты и экскреты, биоптаты органов и тканей человека. Исследование крови часто проводят в целях диагностики арбовирусных заболеваний. В слюне могут быть обнаружены вирусы бешенства, эпидемического паротита, простого герпеса. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителя гриппа, кори, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы обнаруживают аденовирусы. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено-, рео- и ротавирусы.
Для выделения вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы, иногда лабораторных животных.
Источник получения клеток — ткани, извлечённые у человека при операции, органы эмбрионов, животных и птиц. Используют нормальные или злокачественно перерождённые ткани: эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Вирусы человека лучше размножаются в культурах клеток человека или почечных клеток обезьян.
Большинство патогенных вирусов отличает наличие тканевой и типовой специфичности. Например, полиовирус репродуцируется только в клетках приматов, что определяет необходимость подбора соответствующей культуры. Для выделения неизвестного возбудителя целесообразно одномоментное заражение 3-4 культур клеток, так как одна из них может оказаться чувствительной.
Вирусы культивируют на биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (тканей).
Лабораторных животных (взрослых и новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами. Индикацию, т.е. обнаружение факта размножения вирусов, устанавливают на основании развития типичных признаков заболевания, патоморфологических изменений органов и тканей животных или положительной реакции гемагглютинации (РГА). РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных, птиц и человека за счет имеющегося на поверхности вириона особого белка гемагглютинина. Реакцию проводят вне организма — в пробирках (in vitro), по сути она не является иммунологической реакцией. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях в настоящее время весьма ограничено.
Развивающиеся 5—12-дневные куриные эмбрионы заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша (рис.3.3). Индикацию вирусов осуществляют на основании специфических поражений оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния), а также в РГА. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц широко используют при промышленном выращивании вирусов.
23. Культуры клеток. Классификация клеточных культур. Питательные среды для культур клеток. Методы индикации вирусов в культуре клеток.
Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных.
Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.
О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.
Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.
Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре, а для клеток млекопитающих обычно необходима также специальная газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур[6][7]. Как правило, регулируется концентрация в воздухе углекислого газа и паров воды, но иногда также и кислорода. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др[8]. Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами.