Постинфекционный иммунитет напряженный, стойкий, преимущественно гуморальный. Большое значение для защиты организма имеет иммунитет против компонентов слюны клеща.

7. Лабораторная диагностика.

Исследуемый материал – кровь, ликвор, секционный материал.

1. Вирусологический метод.

   1. Выделение вируса на куриных эмбрионах, культурах клеток, мышатах-сосунках.

   2. Индикация – геморрагии эмбриона, ЦПД, РТГАдс, смерть мышат на 3-4 день.

   3. Идентификация – РСК, РТГА, РН с учетом по нейтрализации ЦПД.

2. Серодиагностика (в парных сыворотках).

   1. РСК, ИФА, РТГА.

   2. РН с эталонными лабораторными живыми штаммами вирусов.

Домашнее задание к занятию №15

1. Лабораторная диагностика бешенства, клещевого энцефалита, полиомиелита.

2. Специфическая профилактика и терапия бешенства, клещевого энцефа­лита, полиомиелита.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 16 Дата_________________

Тема: Вирусные инфекции (отчет)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Определить уровень усвоения студентами пройденного материала.

Вопросы для письменного контроля:

1. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций – гриппа, парагриппа, паротита, аденовирусной инфекции, РС-вирусной инфекции, кори, бешенства, клещевого энцефалита, полиомиелита, вирусов ЕСНО и Коксаки.

2. Биопрепараты для специфической профилактики, терапии и диагностики указанных вирусных инфекций.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 17. Дата_________________

ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА РИККЕТСИОЗОВ.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:

1. Обсудить биологические свойства риккетсий.

2. Разобрать этиологию, эпидемиологию, патогенез риккетсиозов.

3. Освоить методы диагностики риккетсиозов.

4. Разобрать состав и получение препаратов, применяемых для диагностики и специфической профилактики риккетсиозов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1. Учет РСК с целью дифференциации эпидемического сыпного тифа (первичного) и болезни Брилля-Цинссера.

Первичный сыпной тиф

Болезнь Брилля-Цинссера

Вывод: ____________________________________________________________

2. Запись биологических препаратов: вакцина Е сыпнотифозная комбинированная живая сухая, вакцина химическая сыпнотифозная сухая, вакцина Ку-лихорадки М-44 живая сухая накожная, риккетсиозные антигены сухи (корпускулярные и растворимые).

ПОЯСНЕНИЯ К ЗАНЯТИЮ.

Классификация

Риккетсии относят к 30 группе по Берджи.

Морфологические свойства.

СТРОЕНИЕ риккетсий аналогично строению бактерий: клеточная стенка построена по типу Гр«-» бактерий, выделяют оболочку, протоплазму и зернистые включения. Ядерная структура представлена зернышками (от 1 до 4); в клетках выделяют РНК и ДНК. Характерен полиморфизм, особенно для риккетсий сыпного тифа.

По П. Ф. Здродовскому (1972) выделяют следующие типы:

Тип а. Кокковидные мелкие гомогенные зернистые клетки овоидно-элипсоидной формы (около 0,5 мкм), часть образуют диплоформы (в виде гантелий) или конгламераты, являются основной морфологической формой, типичные для интенсивного размножения возбудителя в клетках.

Тип в. Палочковидные двузернистые образования (зерна расположены на полюсах, связаны плохо окрашиваемой протоплазмой); средний диаметр 1—1,5 мкм, также характерны для интенсивного размножения возбудителя.

Тип с. Удлиненные или изогнутые двузернистые палочки (3-4 мкм); иногда могут включать по 4 зернышка, попарно расположенных на полюсах; соответствуют более медленному размножению (занимают промежуточное положение между типами а, в, d).

Тип d. Нитевидные (до 20-40 мкм) многозернистые формы, представляющие своеобразный «мицелий» из а- и в- клеток. Характерны для начальных стадий инфекции и фазы замедленного роста.

Токсинообразование.

Токсин своеобразен. От бактериальных экзотоксинов отличается неотделимостью от клеточной стенки и не вызывает интоксикацию после гибели возбудителя, как эндотоксины. Термолабилен, разрушается при нагревании до 60 С.

Для всех патогенных видов характерны гемолитические свойства в отношении

эритроцитов животных.

Эпидемиология, патогенез и клиника.

Патогенез всех риккетсиозов (исключая Q-лихорадку) сходен.

1. После проникновения в организм (с укусом членистоногого переносчика или заноса инфицированных фекалий в место укуса, например при расчесывание) возбудитель активно размножается в эндотелии прилегающих капилляров – эта стадия раннего размножения составляет инкубационный период длительностью 7-10 дней.

а). В течение нескольких первых суток инкубационного периода в месте укуса развивается реакция ГЗТ, иногда сопровождаемая лимфаденопатией.

б). Первоначально риккетсии размножаются в мете первичного очага, затем диссеминируют по лимфотоку; до развития иммунных реакций основной барьер для возбудителя – фагоциты (преимущественно макрофаги), поглощающие их спонтанно. Однако неопсонизированные риккетсии способны выживать и размножаться в их цитоплазме, так как синтезируют фосфолипазы, разрушающие фагосомы; следствие этого – воспалительные реакции в лимфатических узлах, индуцируемые макрофагами.

Через 7-10 суток возбудитель диссеминирует гематогенно. Активное размножение риккетсий в ядрах и цитоплазме эндотелиальных клеток, вызывает васкулиты с образованием переваскулярных мононуклеарных инфильтратов. Пораженные клетки содержат риккетсий в виде телец включений (или клетки Музера), при этом риккетсии Провачека чаще расположены в цитоплазме, а риккетсии Риккетса в ядрах зараженных клеток.

а). По мере диссеминирования возбудителя, поражение сосудов принимают генерализованный характер, что обуславливает клинические проявления — на коже появляется пятнистопапулезная сыпь, в сосудах отмечают диссеминированный тромбоз с развитием ишемии и некротических изменений в переваскулярных тканях.

б). Генерализованное поражение эндотелия приводит к повышению проницаемости сосудов, появлению отеков и геморрагий с развитием гипотензивного шока; поражение эндотелиоцитов активирует свертывающую систему крови с возможным формированием ДВС-синдрома. Смерть наступает от отстрой сердечной недостаточности (основная причина), поражения ЦНС, либо расстройства кровообращения опосредованно приводящие к сердечной недостаточности.

Согласно предположению П.Ф. Здродовского, по характеру вызываемых поражений, представителей рода разделяют на следующие группы:

1. Группа возбудителей сыпного тифа: включает RickettsiaprowazekiiиR.typhi. Возбудители размножаются только в цитоплазме. Первичный аффект отсутствует.R.prowazeka– возбудитель эпидемического (или вшивого) сыпного тифа. Первое клинико – эпидемическое описание сделано Фракосторо (1546), но лишь в середине 19 века сыпной тиф был выделен в отдельную назологическую единицу.Резервуар – больной человек. Переносчик – головная и платяная вши.

-R.typhi– возбудитель эндемического (крысиного) сыпного тифа. Первые случаи, напоминающие сыпной тиф, официально были зарегистрированы в г. Аделаида (Австралия). Заболевание регистрируют в Северной и Южной Америке, бассейнах Северного, Балтийского, Средиземного, Черного и Каспийского морей, в Африке, на Дальнем Востоке, в Северной Австралии. Резервуар – крысы и мыши. Переносчики крысиные блохи и вши.

-Болезнь Брилля – Цинссера (спорадический сыпной тиф) – своеобразная разновидность эпидемических поражений. Характерны эпизодический характер (обычно при отсутствие педикулеза), стертая клиническая картина, трудность выделения возбудителя из крови и наличие выраженных положительных серологических реакций с АГ R.prowazeka. Заболевание регистрируют среди населения, подвергавшегося в прошлом эпидемиям сыпного тифа, а также среди эмигрантов из неблагополучных местностей. Патогенез заболевания связывают с реактивацией риккетсий, сохранившихся в макрофагах.

2. Группа возбудителей клещевой пятнистой лихорадки:

Возбудитель локализуется в цитоплазме и ядре.

-R.ricketsii– возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор и бразильского сыпного тифа. Эндемичен для Северной и Южной Америки. Резервуар – клещи и дикие животные.

Переносчики – клещи.

-R.conorii– возбудитель марсельской средиземноморской лихорадки. Резервуар и переносчик – собачий клещ. Заболевание регистрируют в бассейнах Средиземного, Черного, Каспийского морей, в Кении и Индии.

Для заболевания характерен первичный аффект, возникающий в месте укуса клеща и имеющий вид красноватого инфильтрата, покрытого темной корочкой.

-R.sibirika– возбудитель клещевого сыпного тифа Северной Азии. Регистрируется в Сибири, некоторых регионах Средней Азии, на Дальнем Востоке. Резервуар – грызуны.

Переносчики – иксодовые клещи.

-R.australis– возбудитель североавстралийского клещевого тифа. Вспышки спорадически наблюдают в Северном Куинсленде (Австралия). Предположительный переносчик клещYxodesholocyelus. Резервуар – клещи и мелкие грызуны.

-R.arari– возбудитель осповидного (везикулярного) риккетсиоза. Резервуар – мыши и крысы. Переносчик – гамазовые клещи. Заболевание регистрируется в США, Южной Европе и Центральной Америке.

Первичный аффект в месте укуса имеет вид пузырька, в последствии изъязвляющегося с образованием черного струпа.

3. Группа цуцугамуши.

Лихорадка цуцугамуши известна с глубокой древности, еще в 3 веке до н.э. она была распространена под названием «ша-ши» (заболевание передающееся с укусами мелких красных насекомых).

В настоящее время заболевание регистрируют в Восточной и Юго-Восточной Азии, Индии, Северной Австралии, Приморском крае РФ.

-Trombidiidae. Резервуар – клещи-краснотелок семейства крысы, мыши и бандикуты (сумчатые барсуки семействаPeramelidae). Первичный аффект (выявляют у 60-100% больных) имеет вид плоской язвы 0,3-2 см. диаметром, может быть покрыта плоской темной корочкой. Часто наблюдают пятнисто – папулезную сыпь, появляющуюся к концу первой недели. У 50% больных – умеренное увеличение селезенки. Поражение печени и почек нехарактерны.

К заболеваниям этой группы можно отнести пароксизмальный клещевой риккетсиоз – спорадическое доброкачественное заболевание без первичного аффекта и сыпи (возбудитель не идентифицирован).

-Род Coxiella.

Представлен короткими толстыми палочками 0,2-0,4; 0,2-1 мкм. Размножаются в вакуолях и фаголизосомах клеток, хорошо растут в желточном мешке куриного эмбриона. Образуют споры, обеспечивающие устойчивость к высоким температурам и высушиванию.

Вид C.burnetiiвызывает заболевание, известное какQ-лихорадка. Заболевание регистрируют повсеместно, особенно в районах с развитым животноводством. Переносчики - многие виды иксодовых, аргасовых и газамовых клещей. Резервуар – клещи, грызуны, птицы, домашние животные (крупный рогатый скот). Заражение возможно воздушно – пылевым, алиментарным и трансмиссивным путями.

Инкубационный период варьирует от 10 до 26 суток. Первичный аффект и сыпь обычно отсутствуют. Наиболее постоянный симптом – лихорадка, которая начинается с озноба. На 2-3 сутки температура достигает 39-40 С, длится 3 недели и снижается за 2-4 суток. Характерны ретробульбарные и головные боли, артралгии и миалгии. Особенно характерны поражения легких в виде пневмоний, которые возникают при ингаляции возбудителя.

4. Лабораторная диагностика.

Возбудитель может быть выделен от больных и трупов, из переносчиков и (при эндемических риккетсиозах) от диких животных (обычно грызунов). При всех риккетсиозах исследуемый материал от больного человека – кровь, взятая из вены больного в ранние сроки лихорадки.

1. Экспресс – диагностика.

Для выявления R.rickettsiiиспользуется прямая РИФ, позволяющая идентифицировать Аг возбудителя в кожных биоптатах (чувствительность достигает 70%). Это дает возможность диагностировать заболевание на 3-4 сутки.

2. Биологическая проба (проба Музера – Нейла).

Для проведения пробы наиболее приемлемы самцы морских свинок, которым материал вводят внутрибрюшинно. При большинстве эндемических риккетсиозов у животных развивается периорхит с накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек яичка (клетка Музера).

Для выявления возбудителей везикулярного риккетсиоза и лихорадки цуцугамуши можно заражать белых мышей.

Для диагностики Q-лихорадки рекомендуют заражать морских свинок непосредственно в тестикулы. Однако для выделения риккетсий Провачика эти методы мало эффективны. Выделение возбудителя сыпного тифа можно провести, используя платяных вшей, в желудках которых риккетсии активно размножаются. После кормления вшей инфекцию воспроизводят на чувствительном животном (возбудитель в очень большом количестве накапливается в головном мозге). Таким образом, биопробу можно использовать для дифференциации возбудителей эндемических риккетсиозов от риккетсий Провачика.

Для выделения возбудителя используют также желточные мешки куриных эмбрионов и заражение клеточных культур.

Для обнаружения риккетсий в органах зараженных животных и в культурах клеток готовят препараты и окрашивают их по методу Здродовского и по методу Романовского-Гимзе, затем микроскопируют.

ЛЮБЫЕ МАНИПУЛЯЦИИ С ВОЗБУДИТЕЛЕМ ПРЕДСТАВЛЯЮТ БОЛЬШУЮ ОПАСТНОСТЬ.

3. Серологические реакции составляют основу современной лабораторной диагностики.

Получение надежных (достоверных) результатов возможно лишь к концу первой недели заболевания и лечение следует начинать эмпирически, не дожидаясь результатов лабораторного исследования (имеют больше эпидемиологическое значение).

1). Реакция Вейля – Феликса основана на способности сыворотки пациентов, страдающих различными риккетсиозами, аглютинировать ОХ-штаммы (особенно ОХ-19, ОХ-2).Proteusvulgaris.

Следует помнить, что Ат к возбудителю сыпного тифа перекрестно реагируют только с бактериями штамма ОХ-19, реакция обусловлена структурным сходством поверхностных Аг.

2) РСК – обладает достаточной чувствительностью и специфичностью, мало пригодна для диагностики «свежих» случаев, т.к. для выявления достоверного увеличения титров Ат необходим большой временной интервал. Исследование проводят в парных сыворотках (титры 1:20 – 1:80).

РСК ставят по обычной методике с использованием корпускулярных и растворимых Аг риккетсий. Специфичность данной реакции позволяет дифференцировать риккетсиозы.

3) РА применяется для специфической диагностики всех риккетсиозов и характеризуется высокой специфичностью. Ставится реакция в пробирках с разведениями сыворотки 1:50, 1:100 и т.д. в объеме 0,25 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,25 мл. соответствующего Аг. Через 18 ч. инкубации при 37С учитывают результаты реакции, не встряхивая пробирок.

4) РПГА ставят с растворимым Аг, адсорбированным на поверхности эритроцитов. Исследуемые сыворотки разводят от 1:250 до 1:64000. В отличие от РСК по РПГА нельзя провести внутри групповую дифференцировку риккетсиозов. Однако РПГА позволяет определить фазу инфекции, поскольку гемаглютинирующие Ат накаплаваются в высоком титре на протяжении инфекционного процесса и титр их быстро падает в период реконвалисценции, а через 6 месяцев после выздоровления они исчезают. Использование РПГА в сочетании с РСК позволяет дифференцировать текущее заболевание от перенесенного в прошлом.

Серологическая дифференциация первичного (эпидемического) и повторного сыпного тифа (болезнь Брилля – Цинссера) основана на образовании при этих двух формах болезни различных классов Ig:IgMиIgG, которые отличаются по чувствительности к действию редуцирующих веществ: 2-меркаптоэтанола, цистеина и др., которые вызывают разрывы дисульфидных связей в молекулахIgMи их распад на субъединицы, лишенные антительной активности. Под действием той же концентрации 2-меркаптоэтанола на молекулыIgG, их целостность и антительная активность сохраняется.

Ставят РСК с исходной сывороткой и сывороткой обработанной 2-меркаптоэтанолом или цистеином. В случае первичного сыпного тифа, для которого характерно преобладание

IgMнаблюдается снижение титра Ат в РСК с обработанной сывороткой:

Исследуемая сыворотка	Разведение сыворотки 1:100	Разведение сыворотки 1:200	Разведение сыворотки 1:400	Разведение сыворотки 1:800
Сыворотка, обработанная 2-меркаптоэтанолом	+	_	_	_
Необработанная сыворотка	+	+	+	+

При болезни Брилля – Цинссера, протекающей с преобладанием IgGтитр Ат в обеих сыворотках будет примерно одинаковым (допускается снижение титра не более чем в 2 раза):

Исследуемая сыворотка	Разведение сыворотки 1:100	Разведение сыворотки 1:200	Разведение сыворотки 1:400	Разведение сыворотки 1:800
Сыворотка обработанная 2-меркаптоэтанолом	+	+	+	+
Необработанная сыворотка	+	+	+	+

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ.

1.Препараты для экспресс – диагностики риккетсиозов:

- иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы сыпного тифа

люминесцирующие сухие;

-иммуноглобулины диагностические для выделения риккетсий группы клещевой

пятнистой лихорадки люминесцирующие сухие;

-диагностикум эритроцитарный для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой

лихорадки иммуноглобулиновый сухой для РПГА.

2.Препараты для серодиагностики риккетсиозов:

-диагностикум эритроцитарный сыпнотифозный антигенный сухой для РПГА;

-диагностикум эритроцитарный сыпнотифозный жидкий для РПГА;

-диагностикум рикетсиозный Тифи флюоресцирующий для иммунофлюоресцентной

реакции микроагглютинации;

-диагностикум риккетсиозный Тифи сухой для РСК;

-диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК;

-диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный сухой для РСК, ИФА;

-антиген риккетсиозный Провачека сухой для РНГА;

-диагностикум риккетсиозный Провачека сухой для РСК;

-диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный сухой для РА.

5. Специфическая профилактика.

1.Для эпидемического сыпного тифа.

Вакцина Е сыпнотифозная комбинированная живая сухая. Препарат представляет собой

риккетсии Провачека авирулентного штамма Мадрид Е, выращенные в желточных

мешочках куриных эмбрионов, в комбинации с растворимыми антигенами вирулентного

штамма Брейнль риккетсий Провачека. Стабилизатор и среда высушивания -

обезжиренное коровье молоко. Препарат предназначен для профилактики сыпного тифа

лиц в возрасте 16-60 лет. Ревакцинация проводится раз в 2 года при отсутствии в

сыворотке крови специфических Ат. Иммунитет формируется через 3-4 недели после

прививки у 90% вакцинированных.

2.Вакцина химическая сыпнотифозная сухая. Содержит отчищенную и

концентрированную иммунологическую субстанцию, выделенную методом

солевого осаждения из растворимого антигена риккетсий Провачека, выращенных в

желточных мешках. Препарат предназначен для профилактики сыпного тифа у лиц в

возрасте от 16 до 60 лет. Ревакцинацию проводят по эпидемиологическим показаниям

в любой срок после первичной иммунизации, но не ранее, чем через 4 месяца.

3.Вакцина Ку-лихорадки М-14 живая сухая накожная. Препарат представляет собой

лиофилизированную взвесь живой культры аттенуированного штамма М-44 коксиелл

Бериета, выращенных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов.

Стабилизатор и среда высушивания – обезжиренное коровье молоко. Препарат

предназначен для профилактики Ку – лихорадки у профессиональных групп населения

в возрасте 14 лет и старше, работающих на животноводческих хозяйствах и

предприятиях, неблагополучных по данному заболеванию. Специфический иммунитет

развивается через 3-4 недели прививки и сохраняется в течение года. Проявляется

образованием комплимент – связывающих антител.

3