5. Лабораторная диагностика

Исследуемый материал:

Зависит от формы инфекции (при легочной – мокрота, при других – гной, ликвор, моча).

Методы диагностики:

В исследуемом материале очень мало возбудителей, поэтому проводят обогащение материала (концентрацию возбудителя в меньшем объеме исследуемого материала):

• Метод гомогенизации и центрифугирования в присутствии NaOH

• Метод флотации с ксилолом

1. Экспресс-диагностика

ПЦР

2. Микроскопический метод

Окраска нативного исследуемого материала по Цилю-Нильсену (кислотоустойчивые бактерии – красные, кислотонеустойчивые – синие). Окраска нативного и обогащенного материала люминесцирующими красителями (аурамином) (патогенные микобактерии – золотисто-оранжевые, атипичные формы – зеленые, непатогннные – грязно-серые). Обогащение исследуемого материала проводится центрифугированием (осадок микроскопируется) или методом флотации. Обнаружение в мазках микобактерий дает основание для постановки предварительного диагноза.

3. Бактериологический метод

Является обязательным.

Iэтап: посев обогащенного исследуемого материала, предварительно обработанного кислотой и нейтрализованного щелочью (т.к. микобактерии кислотоустойчивы) на питательные среды:

среда Сотона (солевой раствор, глицерин, аспарагин) – рост в виде морщинистой пленки с ароматическим запахом;

среда Левенштейна-Йенсена (суспензия свежих яиц, аспарагин, картофельная мука, глицерин);

среда Финна (источник азота – глютамат натрия);

среда «Новая» (источник азота – гликокол).

В плотные питательные среды добавляют малахитовую зелень для подавления роста сопутствующей микрофлоры, поэтому среды имеют нежно-зеленую окраску. Инкубация при 37°С до 4 мес., первый учет роста через 14 – 25 дней – для M.tuberculosis, через 24 – 40 дней – дляM.bovis.

IIэтап: изучение выросшей культуры по культуральным (вирулентные культуры микобактерий растут в видеR-форм с образованием слабого розовато-желтого пигмента, атипичные микобактерии и сапрофиты – в видеR-форм с образованием ярко-розового или ярко-желтого пигмента), морфологическим (наличие у патогенных микобактерий корд-фактора) и тинкториальным свойствам. Пересев на скошенный агар для выделения чистой культуры не производим, т.к. культура уже чистая (все некислотоустойчивые бактерии погибли при обработке исследуемого материала кислотой).

IIIэтап: идентификация чистой культуры

• по биохимическим свойствам:

1. Тест, позволяющий отличить M.tuberculosisиM.bovisот других микобактерий: если культуры прогреть при 68°С, то каталазная активностьM.tuberculosisиM.bovisтеряется, в отличие от других микобактерий;

2. Тест, позволяющий отличить M.tuberculosisотM.bovis: ниациновая проба (ниациновый тест, проба Кона) –M.tuberculosisв отличие отM.bovisспособна синтезировать никотиновую кислоту (в среду Соттона добавляют 1 мл 5% хлорамина и 1 мл цианистого калия, в присутствии никотиновой кислоты образуется ниацин – желтое окрашивание среды);

3. Тест, позволяющий отличить M.tuberculosisотM.bovis:M.tuberculosisв отличие отM.bovisспособна восстанавливать нитраты в нитриты.

4. Биологический метод

Производят заражение лабораторных животных исследуемым материалом от больного (к M.tuberculosisчувствительны морские свинки; кM.bovis– кролики). Учет через 3 – 4 месяца.

5. Метод кожно-аллергических проб

Проба Манту (в основе лежит гиперчувствительность замедленного типа – антителнезависимая). Проводится внутрикожно с аллергеном (туберкулин). Туберкулин – очищенный белок из микобактерий туберкулеза – ППД-Л (пурин-протеин-дериват Линниковой) в количестве 2 ЕД. Учет через 72 часа. Различают отрицательную, нормэргическую (5 – 16 мм) и гиперэргическую реакцию. Об инфицировании судят по виражу туберкулиновой пробы (учет по туберкулиновому ряду в динамике).

6. Ускоренный метод диагностики

Метод Прайса (метод микрокультур). На стекло наносится обогащенный исследуемый материал, предварительно обработанный кислотой и нейтрализованный щелочью, вертикально погружается в цитратную кровь на 10 - 14 дней, затем сушится, фиксируется, окрашивается по Цилю-Нильсену. В иммерсионный микроскоп видны микобактерии в виде кос или нитей войлока, благодаря наличию у патогенных микобактерий корд-фактора.