Биохимия / Определение концентрации креатинина

Определение концентрации креатинина в биологических жидкостях кинетическим методом

Принцип метода: Кинетический метод без депротеинирования (осаждения белка) основан на цветной реакции Яффе (Jaffe). Креатинин в щелочной среде образует с пикриновой кислотой окрашенный (оранжевый) комплекс.

Изменение оптической плотности пробы за фиксированное время при длине волны 490-510 нм прямо пропорционально концентрации креатинина в ней.

Линейность метода: до 1,33 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 53-97 мкмоль/л (25-37С);

женщины – 44-80 мкмоль/л (25-37С).

Суточная моча – 88,5-133 ммоль/л.

Концентрация креатинина сохраняется стабильной в образцах при температуре хранения 2-8С в течение 1 суток.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 490-510 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 50 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови/ суточная моча. Мочу предварительно развести деионизированной водой в соотношении 1:50. Кроме сыворотки можно использовать гепаринизированную плазму;

5. Реагент 1 (гидроксид натрия 160 ммоль/л);

6. Реагент 2 ( пикриновая кислота 4,0 ммоль/л);

7. Стандарт (раствор креатинина 177 мкмоль/л);

8. Дистиллированная вода.

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	50 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	50 мкл
3. Дистиллированная вода	--	50 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Точно через 60 секунд измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 490-510 нм (оптическая плотность А₁). Повторить измерение через 60 секунд (оптическая плотность А₂). Рассчитать изменение оптической плотности за минуту для опытной и стандартной проб:

А_оп = А_2оп – А_1оп;

А_ст = А_2ст – А_1ст.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации креатинина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:

Аоп С (мкмоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А_{оп / ст} – изменение опт.плотн. в минуту;

С_ст – концентрация стандарта.

Расчет по стандарту концентрации креатинина в суточной моче проводят по формуле:

Аоп С (ммоль/л) = -----------  Сст  50, Аст

где А_{оп / ст} – изменение опт.плотн. в минуту;

С_ст – концентрация стандарта;

50 – коэффициент разведения.

Если концентрация креатинина превышает 1,33 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Нельзя анализировать иктеричные образци, так как билирубин искажает результаты измерений.

Клинико-диагностическое значение: Определение концентрации креатинина проводят для исследования функции почек. При значительном ухудшении функции почек концентрация креатинина в сыворотке увеличивается.

У здоровых людей концентрация креатинина в сыворотке относительно постоянна и мало зависит от пола, возраста, диеты, так как образование креатинина в мышцах как конечного продукта метаболизма относительно постоянно.

Клиренс эндогенного креатинина используют в качестве меры клубочковой фильтрации.