Биохимия / Определение мочевой кислоты
.docОпределение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях ферментативным методом
Принцип метода: Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до алантоина с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин с N-этил-N-(гидрокси-3-сульфопропил)-m-толуидином [TOOS]) с образованием сине-фиолетового красителя:
УриказаМочевая кислота + Н2О + О2 ----------------> Алантоин + СО2 = Н2О2
|
Пероксидаза2Н2О2 + ТООS + 4-Амноантипирин ------------------------> Индамин + 3Н2О
|
Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации мочевой кислоты в нем.
Линейность метода: 65,7 -1190 мкмоль/л.
Норма:
Сыворотка крови – мужчины – 214-488 мкмоль/л (25-37С);
женщины – 137-363 мкмоль/л (25-37С).
Концентрация мочевой кислоты сохраняется стабильной в сыворотке/ плазме в течение 3 дней при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 6 месяцев.
Стабильность концентрации мочевой кислоты в моче – 4 дня при комнатной температуре.
Оборудование и реагенты:
-
Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;
-
Секундомер;
-
Автоматические пипетки на 20 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;
-
Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА- плазма / моча. Мочу предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;
-
Реагент 1 (ТООS 1 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);
-
Реагент 2 (уриказа 50 Е/л, пероксидаза 1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);
-
Стандарт (раствор мочевой кислоты 357 мкмоль/л);
-
Дистиллированная вода.
Проведение анализа
Добавить в кювету |
Опытная проба |
Холостая проба |
Стандартная проба |
1. Образец (например, сыворотка) |
20 мкл |
-- |
-- |
2. Стандарт |
-- |
-- |
20 мкл |
3. Дистиллиро-ванная вода |
-- |
20 мкл |
-- |
4. Реагент 1. |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин |
|||
5. Реагент 2 |
250 мкл |
250 мкл |
250 мкл |
Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (оптическая плотность А). Окраска стабильна в течение 30 минут.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в биологической жидкости проводят по формуле:
Аоп С (мкмоль/л) = ----------- Сст, Аст |
где Аоп / ст – изменение опт.плотн. в минуту;
Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л).
Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в моче проводят по формуле:
Аоп С (ммоль/л) = ----------- Сст 11, Аст |
где Аоп / ст – изменение опт.плотн. в минуту;
Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л);
11 – коэффициент разведения.
Если концентрация мочевой кислоты превышает 1190 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Мочевая кислота и ее соли являются конечными продуктами пуринового обмена.
При подагре, наиболее общем осложнении гиперурикемии, повышенный уровень мочевой кислоты в сыворотке крови ведет к образованию вокруг суставов кристаллов моноуреата натрия. Гиперурикемия наблюдается также при заболеваниях почек с пониженной экскрецией отходов жизнедеятельности, при голодании, употреблении наркотиков, избыточном потреблении алкоголя, а также при приеме некоторых лекарств. Гиперурикемия – составная часть непрямого фактора риска коронарной болезни сердца.
Гипоурикемия наблюдается редко и связана с редкими наследственными нарушениями метаболизма.