Мембранные фрагменты

При работе с некоторыми клетками, например, с изолированными с помощью ферментов клетками миокарда, гигаомные контакты иногда формируются спонтанно, при прикосновении кончиком пипетки к поверхности клетки высокоомный контакт формируется без подсасывания. В этом случае не наблюдается никаких деформаций клеточных мембраны, и площадь мембранного фрагмента можно оценить по значению сопротивления пипетки до образования контакта. Но в большинстве случаев контакт формируется только при небольшом разрежении, создаваемом внутри пипетки. При этом поверхность мембраны деформируется, часть её втягивается внутрь пипетки на 2-3 мкм, принимая Q-образную форму. Когда фрагмент изолируют механическим отведением кончика пипетки от поверхности клетки, его У-образная форма практически не изменяется. При дальнейшем подсасывании образуется сферический пузырёк. Если известна удельная ёмкость мембраны (как правило, она составляет 1 мкф/см2), площадь фрагмента можно оценить по величине его ёмкости; обычно площадь варьирует от 2 до 25 мкм2.

Электронные схемы для пэтч-кламп регистрации

Электронная схема пэтч-кламп регистрации должна иметь такие параметры, чтобы было возможным зарегистрировать передвижение всего лишь нескольких сотен элементарных электрических зарядов через малый участок клеточной мембраны. При максимально сниженных собственных шумах измерительной аппаратуры, токи через одиночные электровозбудимые Са-каналы, можно зарегистрировать только в нефизиологических условиях – например, при использовании растворов, содержащих Ва2+ вместо Са2+.

Стандартным методом измерения малых токов является регистрация создаваемого ими падения напряжения на высокоомном сопротивлении. На рис.3 представлен три электрические цепи, с помощью которых осуществляются подобные измерения. Наиболее удобно автоматическое поддержание требуемого значения Vб с помощью операционного усилителя, который представляет собой управляемый потенциалом источник напряжения ( рис.3, в).

Регистрация от целой клетки в условиях плотного контакта

Несмотря на то, что метод пэтч-кламп был разработан для регистрации токов через одиночные каналы, пэтч-пипетки можно с успехом использовать также для регистрации токов от целой клетки (РЦК), особенно когда размеры её невелики. После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под пипеткой можно разрушить, прикладывая к ней короткие импульсы отрицательного давления. Такая манипуляция в большинстве случаев не нарушает контакта пипетки с мембраной, и в результате между пипеткой и содержимым клетки устанавливается хорошо изолированный от омывающего раствора проводящий путь. Такой способ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений, чем введение стандартного микроэлектрода. Входное сопротивление небольших клеток велико по сравнению с эффективным сопротивлением кончика пипетки, поэтому при работе с ними электрические измерения можно проводить от участка мембраны намного большей площади, чем у исходного фрагмента. В отличие от разных вариантов ПК регистрации этот метод позволяет осуществить регистрацию от мембраны целой клетки, а не от маленького мембранного фрагмента.

Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим раствором с низкой концентрацией ионов кальция. Пипетку прижимают к поверхности клеточной мембраны, в результате чего формируется высокоомный контакт. Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт. На этом этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты, обусловленной ёмкостью держателя и стенок пипетки. К пипетке прикладывают импульсы отрицательного давления до тех пор, пока вновь не появятся ёмкостные переходные процессы (возникает дополнительный ток).

Регистрацию от целой клетки можно проводить в течение часа без визуальных или электрических признаков нарушения мембраны. Если исследуемая клетка плотно прикрепилась к культуральной чашке, плавным отведением её от пипетки можно получить конфигурацию outside-out. После такой процедуры клеточная мембрана быстро “зашивается” и клетка является интактной. Но содержимое клетки соответствует раствору в пипетке. Это используется в различных целях:

1. для изменения содержимого выбранной клетки с минимальным повреждением её мембраны.

2. Для проведения исследований с различными внутриклеточными растворами на одной и той же клетке путем смены регистрирующих пипеток.

3. Для регистрации в одном эксперименте интегральных токов и одиночных каналов.

Пипетки должны быть сравнительно широкими и иметь кончики с большим углом схождения.

Между раствором в пипетке и содержимым клетки происходит быстрый обмен, поэтому раствор для заполнения пипеток должен быть близок по своему составу к клеточному содержимому.

Таб. 2. Типичные электрические параметры,

получаемые при регистрации на хромафинных

клетках в конфигурации РЦК

Последовательное сопротивление, Rs	4 МОм
Ёмкость клетки, C	5 пФ
Пост. Времени фиксации потенциала, RsC	20 мкс
Пост. Времени обмена ионов, tоб	5с
Сопротивление клетки, R	10ГОм
Сопротивление утечки, Rут	20ГОм
Шум (среднеквадр. значение, 0-400 Гц)	0,15 пА

Данные таблицы отличаются от значений, полученных с обычными стеклянными микроэлектродами по трем основным пунктам:

1. большинство клеток с диаметром менее 20 мкм при прокалывании обычным микроэлектродом повреждается, в то время как РЦК можно проводить даже на клетках диаметром менее 10 мкм, совершенно не нарушая их.

2. Сопротивление утечки микроэлектрод-клетка при использовании обычных микроэлектродов не превышает 500 МОм, в то время как соответствующее значение сопротивления утечки при РЦК могут быть 20 ГОм и более.

3. Обычные микроэлектроды имеют сопротивление кончика Rs более 100 МОм, а типичные значения для РЦК на хромафинных клетках составляют 4 МОм.

Метод РЦК применяется для регистрации токов в мембране опухолевых клеток гипофиза, внутренних сегментов палочек сетчатки, островковых клеток поджелудочной железы, клеток миокарда, наружных сегментов палочек сетчатки, нейронов спинного мозга млекопитающих и др.

Пэтч-кламп регистрация при неплотном контакте

Метод регистрации от целой клетки в условиях плотного контакта позволяет регистрировать ионные токи, протекающие через небольшие мембранные фрагменты, которые содержат только один или несколько ионных каналов. Для получения информации о кинетике работы каналов или о плотности токов через мембрану проводится одновременная регистрация работы множественных каналов с использованием метода пэтч-кламп или применяется классический метод фиксации мембранного потенциала.

Регистрация при неплотном контакте по сути идентична регистрации одиночных каналов, за исключением того, что участок мембраны, на котором фиксируется потенциал, на 3 порядка больше, и при этом не требуется формирования гигаомных контактов.

Метод позволяет без труда получать стабильные электрофизиологические данные от локальных участков мембраны, используя интактные клетки практически без их изоляции или других видов обработки. Например, можно проводить измерения на целой мышце, не выделяя одиночные клетки. Отпадает необходимость и в использовании внутриклеточных микроэлектродов.

Однако, необходимо отметить, что наиболее корректную информацию о мембранной проводимости всё-таки даёт регистрация токов через одиночные каналы, так как позволяет избавиться от ряда артефактов, которые могут быть получены при регистрации макроскопического тока. Имеются, по крайней мере, четыре основные проблемы, с которыми приходится сталкиваться при регистрации макроскопических токов. Во-первых, трудно создать условия для регистрации тока только через каналы интересующего нас типа. Во-вторых, влияние последовательного сопротивления

может приводить к различию между истинным мембранным и поддерживаемым потенциалом. В-третьих, накопление ионов в примембранной области может вызывать зависящее от времени изменение тока через отдельные каналы. И, наконец, потенциал-зависимость проводимости открытого канала может быть ошибочно принята за потенциал-зависимость активации канала.

Задача: исследование трансмембранных ионных токов

 Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов. Каждая клетка должна обмениваться с внешней средой различными веществами и в частности ионами. Перенос ионов через мембрану играет важную роль в процессах возбуждения клетки и передачи сигналов. Ионы проникают в клетку и выходят из нее через встроенные в мембрану белковые структуры — каналы и транспортеры.

Транспортеры — это мембранные белки, которые соединяются с переносимым веществом по одну сторону мембраны, переносят это вещество через мембрану и затем его освобождают. Такой перенос становится возможным потому, что в результате соединения с веществом транспортер меняет конформацию (т.е. форму, ориентацию). Бытовой аналогией транспортера является лифт, который "присоединяет" к себе людей, переносит их на другой этаж и "освобождает". Важнейший транспортер в клетках эукариот — это натрий-калиевый насос. Для работы этого насоса требуется энергия, которую он черпает из запасенной в клетке АТФ. За один цикл своей работы насос выводит из клетки 3 иона Na⁺ и вводит в нее 2 иона K⁺. Одна молекула этого транспортера совершает примерно 10³ циклов в секунду. Сходная частота циклов характерна и для других видов транспортеров.

 Каналы — это белки, которые выполняют функцию мембранных пор, так как формируют отверстия, сквозь которые могут проходить ионы. Мембранные каналыселективны — проницаемы только для определенных веществ. Селективность обусловлена радиусом пор и распределением заряженных функциональных групп в них. Существуют каналы, селективно пропускающие ионы натрия (натриевые каналы) и ионы калия (калиевые каналы), а также хлоридные каналы. Для каждого вида ионов существует не один, а довольно много видов каналов. Сквозь один канал за секунду проходит 10⁶ — 10⁷ ионов.

Несмотря на фундаментальные различия в механизме транспорта через каналы и транспортеры, они могут быть образованы высоко гомологичными белками. Так, недавно получены данные, что мутация единственной аминокислоты в белке транспортера двухвалентных металлов DMT1 приводит к его превращению в кальциевый канал . Кроме того, существует по крайней мере один транспортер (хлорид-бикарбонатный обменник эритроцитов), осуществляющий 10^{5 переносов в секунду, что очень близко к скоростям, характерным для каналов, и заставляет предположить существование у него некоего «промежуточного» между каналами и транспортерами механизма.}

Так как ионы — это электрически заряженные молекулы, при их переходе через мембранные каналы переносится и заряд, а значит, через мембрану течет электрический ток. Этот ток можно измерить. Чем больше разность потенциалов между сторонами мембраны, тем больше ток. Проводимость (отношение тока к разности потенциалов) одиночного канала в открытом состоянии варьируется в зависимости от вида канала, от 1-2 до 30-50 пикосименсов. Это значит, что при разности потенциалов равном 100 мВ через канал потечет ток в несколько пикоампер.

Решение: история вопроса.

Один внутриклеточный электрод. Измерение разности потенциалов.

Первоначально электрические явления на клеточных мембранах измеряли с помощью острых стеклянных микроэлектродов, вводившихся в клетку. Техника с одним внутриклеточным электродом позволяет измерять разность потенциалов или ток, но не даёт возможности фиксировать их на определенном уровне, так что во время исследования одновременно меняются оба параметра. Кроме того, классические острые микроэлектроды дают возможность измерения исключительно на целой клетке, которая имеет, как правило, различные типы белков и транспортеров. Все это, вместе взятое, сильно затрудняет интерпретацию данных, полученных таким методом.

Двухэлектродная фиксация потенциала.

Тот факт, что фиксация трансмембранного потенциала позволит измерять мембранную проводимость по изменениям тока при постоянном напряжении, был впервые осознан еще в 30-х гг. XX века, и тогда же английские исследователи Алан Ходжкин и Эндрю Хаксли (Alan Hodgkin and Andrew Huxley) начали эксперименты с двухэлектродной фиксацией потенциала (}).

Суть метода состоит в следующем. В клетку вводятся два электрода, еще один - электрод сравнения - остается вне клетки. Первый внутриклеточный электрод служит для измерения трансмембранной разности потенциалов (то есть разности потенциалов между ним и электродом сравнения), второй может подавать ток. Специальное устройство — генератор сигнала — задаеткомандный потенциал, которому должен быть равен трансмембранный потенциал. Измеренный трансмембранный потенциал подается на вход устройства сравнения, которое вычитает измеренный потенциал из командного и, в зависимости от величины разности, подает ток на токовый электрод, так, чтобы скомпенсировать эту разницу. Монитор тока, в свою очередь, постоянно измеряет величину тока, которая для этого необходима. В 1930-х и 40-х годах, когда работали Ходжкин и Хаксли, не существовало микроэлектродов, поэтому в качестве внутриклеточных электородов использовались тонкие проволоки. Это определило выбор объекта — единственной животной клеткой, в которую можно было ввести две изолированные друг от друга проволоки, был гигантский аксон кальмара. На этом объекте методом двухэлектродной фиксации потенциала исследователи выполнили эксперименты, в которых была установлена ионная природа потенциала действия и впервые постулировано существование ионных каналов(Нобелевская премия 1963 г., поделена с Дж.Экклзом, получившим ее за исследования в области синаптической передачи). Двухэлектроднная фиксация потенциала применяется и в настоящее время, с использованием острых стреклянных микроэлектродов, однако даже с ними эта методика имеет существенные ограничения: во-первых, два электрода могут быть введены только в весьма крупную клетку (например, ооцит лягушки), во-вторых, она позволяет измерять проводимость всей клеточной мембраны, со всеми, как правило разнородными, каналами в ней.

Решение: patch-clamp, его варианты и конфигурации

Гигаомный контакт

В конце семидесятых годов XX в. E.Neher и B.Sakmann обнаружили, что если стеклянной пипеткой с диаметром 1-2 микрона коснуться клеточной мембраны, то на границе "мембрана — стекло" образуется контакт с сопротивлением в несколько гигаОм — это так называемый гигаомный контакт . Он позволяет изолировать от внешней среды и от остальной части мембраны тот ее фрагмент, который находится внутри пипетки. Отграниченный пипеткой фрагмент мембраны и называется patch — «заплатка», слово clamp (фиксация) в названии метода имеет два значения: (1) захват и изоляция этой «заплатки» и (2) фиксация трансмембранного потенциала или тока в изолированном фрагменте, или, как будет описано позже, целой клетке. В пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Отличие электрической схемы от ранее описанной для двухэлектродной фиксации заключается в том что один и тот же электрод используется как для измерения разности потенциалов, так и для подачи тока. В основе установки, тем не менее, по-прежнему лежат усилитель мембранного потенциала, блок сравнения и монитор тока.

На фото 1 показана часть такой установки.

Огромная сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии — это клетка (ооцит лягушки Xenopus laevis), находящийся в данный момент на предметном столике микроскопа, к нему подведена patch-пипетка, ее диаметр у носика — около 3 микрон. После установления гигаомного контакта она изолирует фрагмент мембраны площадью приблизительно 7 мкм², и если в этом фрагменте окажутся ионные каналы, их ток можно будет записывать.

Конфигурация «Cell-attached»

Только что описанная конфигурация называется cell-attached patch-clamp (patch-clamp «на клетке»).

Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства.

Во-первых, она не позволяет с достаточной надежностью измерять, а следовательно, и задавать трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Вообще говоря, можно, используя омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но все это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам неизвестен.

Во-вторых, эта конфигурация не позволяет контролировать состав среды вне пипетки — там остается цитоплазма, состав которой не вполне определен.

В силу этих причин cell-attached mode применяется довольно ограниченно.

Конфигурация Inside-out

Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то «внутренний» кусочек мембраныоторвется от клетки и получится конфигурация inside-out (наружная сторона внутри), названная так потому что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны окажется снаружи — в омывающем растворе, а наружная — внутри пипетки. Альтернативный метод перехода в конфигурацию inside-out заключается в следующем: из конфигурации cell-attached пипетку отводят плавно, формируя с двух сторон закрытую везикулу; затем поднимают пипетку в воздух и опускают во вторую ванночку, с внутриклеточным раствором. При переносе внешняя мембрана везикулы разрушается, в результате формируется конфигурация inside-out.

Теперь разность потенциалов на фрагменте мембраны строго равна разности потенциалов между электродами. Очевидно, что при использовании такой модификации пипетку заполняют раствором, имитирующим внеклеточную среду, тогда как омывающий раствор делают близким по составу к цитоплазме. При этом, меняя состав омывающего раствора, можно изучать, как такие изменения в цитоплазме влияют на ток интересующих нас каналов —ведь омывающий раствор контактирует с цитоплазматической стороной мембраны).При этом мы точно знаем как состав жидкости по обе стороны мембраны, так и разности потенциалов, что позволяет достаточно точно характеризовать каналы, используя уравнения Нернста и Гольдмана-Ходжкина-Каца, так что на этом уровне электрофизиология превращается в биофизику каналов. при этом, если в изолированный участок мембраны попал один канал, то мы наблюдаем поведение единичной молекулы и, если это лиганд-регулируемый канал-рецептор, то ее взаимодействие с другими единичными молекулами.

Конфигурация Whole-cell

Если по условиям эксперимента необходимо менять состав внеклеточной среды, можно использовать конфигурацию whole cell («»). В этом случае пипетку не отводят от клетки, а подают в нее отрицательное давление и таким образом разрушают изолированный фрагментмембраны.

После этого пипетка соединена с внутриклеточной средой; поскольку клетка обычно маленькая, то, благодаря диффузии, состав цитоплазмы вскоре оказывается идентичным составу пипеточного раствора, поэтому мы, как и в предыдущем случае, знаем как состав жидкостей, так и разность потенциалов. Отметим, что если в конфигурации inside-out пипеточный электрод был внеклеточным, а внутренний — внутриклеточным, то теперь их роли изменились, так что задавая потенциал, необходимо инвертировать полярность. Преимущество этого метода состоит и в том, что здесь оказываются сохранны все клеточные структуры и регуляторные механизмы. Но есть и недостаток — мы измеряем суммарный ток всех каналов в клетке, между тем одно из главных достоинств patch-clamp состоит в возможности изучения отдельных молекул.

Конфигурация Outside-out

Решить эту проблему позволяет конфигурация outside-out (наружная сторона снаружи). Если после перехода в whole-cell mode медленно отводить пипетку от клетки, мембрана не отрывается сразу, а начинает вытягиваться в трубку

Обратите внимание — в пипетке отчетливо видны кусочки цитоплазмы, попавшие туда после разрушения мембраны при переходе в whole-cell.

Следующая фаза процесса представлена на фото 6.

Мембранная трубка стала совсем тонкой и почти невидима («протуберанец» у поверхности клетки — это небольшая часть цитоплазмы, оставшаяся в мембранной трубке). В следующее мгновение трубка порвется, а мембрана сомкнется на пипетке в «вывернутом» виде — мы окажемся вконфигурации «outside-out»

Итак, пипетка и ее электрод — подобно конфигурации whole-cell — внутриклеточные, мы свободно меняем состав внеклеточного раствора, площадь исследуемой мембраны невелика, так что мы вновь можем изучать одиночные каналы.

Perforated patch

Perforated patch («продырявленный patch»)— это специфический вариант patch-clamp в whole-cell mode. В данном случае, после формирования гигаомного контакта в пипетку подаётся новый раствор, содержащий небольшое количество специального антибиотика, например Амфоторецина-В либо Грамицидина. Антибиотики этого класса образуют отверстия в клеточной мембране на участке, присоединенном к электроду.

Такой подход позволяет избежать замещения внутренней среды клетки раствором из пипетки-электрода, то есть клетка остаётся живой с минимальными, насколько это возможно, повреждениями. Таким образом, ответы клетки на раздражители являются максимально приближёнными к естественным. В то же время, данному методу присущ ряд едостатков. Во-первых, по сравнению с классическим whole-cell mode, электрическое сопротивление доступа (которое состоит из сопротивления пипетки и сопротивления в месте соединения пипетки с мембраной) является значительно более высоким. Это понижает уровень распознавания электрического тока, повышает уровень шума при записи, и экспоненциально увеличивает значения всех ошибок, связанных с флюктуациями сопротивления полной цепи (от электрода во внешнем растворе до электрода в пипетке). Во-вторых, для того, чтобы антибиотик подействовал, требуется довольно много времени (до 30 минут), что существенно уменьшает полезный период эксперимента. И в-третьих, антибиотик повреждает мембрану также и в месте соединения с кончиком пипетки, что приводит к ускоренному разрушению гигаомного контакта и дополнительно уменьшает эффективное экспериментальное время. Таким образом, данный вариант метода может быть с успехом использован только в экспериментах, которые не требуют продолжительного времени для выявления исследуемых явлений.

Nuclear patch

Интересная разновидность patch-clamp — nuclear patch. (Фиксация потенциала с клеточным ядром).

Этот метод применяется в случае, когда количество исследуемых каналов на поверхностимембраны мало. Основной целью данного метода является повышение вероятности попадания единичного рецептора на пипетку путём увеличения площади отрываемого от клетки участкамембраны; сам же метод состоит в следующем. Пипетка подводится к клетке, а затем рывком пробивает мембрану. После этого кончик пипетки подводится к клеточному ядру, на пипетку подается небольшое отрицательное давление. В результате пипетка присасывается к ядру. Затем пипетка с ядром на конце плавно отводится назад и вынимается из клетки. Пипетку необходимо вывести из клетки таким образом, чтобы участок мембраны в месте выхода «наделся» на присосавшееся ядро и оторвался, обернувшись вокруг него. В результате получается специфический вариант outside-out patch, при котором гораздо больший, чем в обычном варианте метода, участок мембраны присоединён к концу пипетки, будучи обёрнутым вокруг клеточного ядра. Таким образом, вероятность нахождения нужного единичного рецептора на оторванном участке мембраны заметно повышается.

Фиксация потенциала и фиксация тока

Когда изучаются изменения проводимости однотипных каналов в ответ на какие-то химические воздействия или зависимость их проводимости от разности потенциалов на мембране, удобно фиксировать потенциал и измерять ток канала — как мы до сих пор и описывали. Этот, самый частый вариант patch-clamp, называется voltage clamp (фиксация потенциала). Однако, иногда исследователя интересуют процессы трансмембранного переноса ионов, связанные с изменением мембранного потенциала — например, проведение нервного импульса. В таких случаях можно поступить противоположным образом: зафиксировать на постоянном уровне ток (например, можно предположить, что суммарный ток через все ионные каналы в каждый момент времени равен нулю, соответственно установить нулевой ток), и изучать изменения разности потенциалов при этом. Такой вариант называется current clamp (фиксация тока).

Примеры записей, получаемых методом patch-clamp

Запись одиночного канала рецептора глицина. Четко видны два состояния: закрытое (ему соответствует нулевой ток) и открытое (ему соответствует ток примерно в 7 пикоампер). Канал время от времени спонтанно переходит из одного состояния в другое, промежуточных состояний нет. Запись позволяет получить две важнейшие характеристики канала: проводимость (исходя из величин трансмембранного потенциала и тока) и вероятность нахождения в открытом состоянии (определяемое как отношение времени, когда канал открыт к времени, когда он закрыт). К слову, чаще всего активность канала физиологически регулируется путем изменения этой вероятности). [[Изображение:2006 01 12R1.gif|thumb|300px|Рисунок 10. Запись амилорид-чувствительного тока эпителиального натриевого канала в конфигурации whole-cell.]] Запись в конфигурации whole-cell. Клетка эпителия собирательной трубки. Трансмембранный потенциал −60 мВ. С интервалами в 1 минуту на 30 секунд в омывающий раствор вводится амилорид — ингибитор эпителиального натриевого канала. Кстати, чувствительность к ингибиторам — это еще одна из важнейших характеристик канала. Введение амилорида всякий раз приводит к падению тока до нуля, из чего следует, что практически вся проводимость при −60 мВ в данной клетке — это проводимость эпителиального натриевого канала. В противоположность предыдущей записи, изменения тока выглядят непрерывными — это связано с тем, что одновременно записывается много каналов (около 2000), соответственно, имеется примерно 2000 уровней тока — от «все открыты» до «все закрыты».

Литература:

1. Малиновский А.А. Тектология. Теория систем. Теоретическая биология.

2. Человеческий потенциал: опыт комплексного подхода. Ред. Фролов И.Т.

3. Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа.