Амплификация – увеличение
количества ампликонов в ходе многократно (обычно 30-50 раз) повторяющихся циклов (раундов) денатурации, гибридизации и
удлинения цепейЭтапы ПЦР
•Денатурация ДНК (~ 950 C)
•Отжиг (гибридизация) праймеров на ДНК
(~ 550 C)
•Синтез фрагмента ДНК (элонгация) с
помощью термостабильной ДНК-полимеразы (~ 720
C) |
|
Реакция повторяется 30-50 циклов, |
|
количество специфического фрагмента |
|
ДНК возрастает в 1-10 млн. раз |
21 |
праймер или зонд (синтетический фрагмент ДНК)
соответствующий участок
матрицы (мишени)
ДНК
праймеры – короткие синтетические молекулы ДНК, ограничивающие синтезируемый фрагмент
гибридизация – образование комплекса праймера и матрицы:
праймер
соответствующий участок матрицы (мишени)
произошла денатурация (расхождение) цепей двуцепочечной ДНК и гибридизация участка каждой из цепей с комплементарным ему праймером
Фермент ПЦР –Taq полимераза (выделена из бактерии Thermus aquaticus)
Термостабильна - может выдерживать длительное нагревание при 950С и многократную смену температуры с
сохранением активности
Удлинение цепей ДНК-
полимеразой
Продукт ПЦР – двуцепочечный специфический фрагмент ДНК (ампликон)
стандартный температурный режим одного цикла
94-96° С
денатураци
я
(плавление
двуцепочеч ной ДНК- матрицы)
10 сек – 2 мин
50-65 ° С
отжиг
(гибридизация праймера и одноцепочечной матрицы)
10-40 сек
многократное
повторение
72 ° С
удлинение праймера на матрице полимеразой и образование новой копии двуцепочечной ДНК
Обратная транскрипция и
ПЦР
Дополнительная стадия для РНК-содержащих возбудителей
РНК не может быть матрицей для ПЦР! |
кДНК |
|
Фермент – обратная |
далее ПЦР по |
|
описанной |
|
|
транскриптаза (ревертаза) |
выше схеме |
|
|
|
|
праймер
РНК
ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с предшествующей ей стадией обратной транскрипции
Детекция результатов
По конечной точке |
|
В реальном времени |
||
(после окончания |
|
(после каждого цикла) |
||
реакции) |
|
|
||
Электрофорез |
ГИФА |
FLAS |
Реал- |
|
|
|
|
H |
|
|
|
|
|
|
Детекция
электрофорезом
Разделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их зарядом и линейными размерами
M P S1 S2 S3 S4 S5 S6 N M P S7 S8 S9 S10S11S12 N M
ГИФА – гибридизационный
иммуноферментный(вариант анализа «по конечнойанализ
|
|
точке») |
|
||
|
|
перенос |
гибридизация |
||
|
реакционной смеси |
||||
амплификация |
ампликонов в |
||||
|
в лунки |
||||
|
|
лунках с |
|||
|
иммунологического |
||||
|
иммобилизованным |
||||
|
|
планшета |
|||
|
|
зондом |
|||
|
|
|
|
||
|
|
отмывки |
определение |
реакция с |
|
|
оптической |
конъюгато |
|
плотности |
м |
|
|
|