Экспрессия генов Патрушев

671

весьма вероятными. Действительно, в природе, по-видимому, не существует ферментов с абсолютной субстратной специфичностью, и полифункциональность является изначальным и фундаментальным свойством сложных полипептидов. Какой бы узкой ни была субстратная специфичность ферментов по отношению к природным субстратам, для них всегда можно синтезировать искусственные субстраты, расширяющие их субстратную специфичность. Полифункциональность описана для многих природных белков. Например, кристаллины (одни из основных белков хрусталика глаза позвоночных) у млекопитающих являются одновременно малым белком теплового шока неизвестной функции, у птиц и рептилий обладают активностью аргининосукцинатлиазы, другая же форма (δ) у рыб и рептилий обладает лактатдегидрогеназной активностью и является ДНК-связывающим белком. Изоформа кристаллинов τ, характерная для рыб, птиц и рептилий, является одновременно α-энолазой и белком теплового шока. У гемоглобина – основного переносчика кислорода и углекислого газа животных, обнаружены анилингидроксилазная, каталазная и пероксидазная активности. Все вышеперечисленные активности гемоглобина, по-видимому, не имеют физиологического значения и могли возникнуть именно как побочные активности в процессе эволюционирования основной функции этого белка.

Еще более яркий пример такого рода демонстрируют абзимы (антитела, обладающие ферментативной активностью). Помимо хорошо известной гидролитической активности абзимов в отношении различных эфиров и кокаина описана их способность осуществлять синтез амидов, реакции стереоспецифической циклизации, перегруппировку Клайзена, приводящую к образованию префеновой кислоты из хоризмовой, а также ряд других реакций. Сколько же потенциальных ферментативных активностей заключено во всей популяции антител одного индивидуума, репертуар которых практически безграничен благодаря запрограммированному процессу соматического мутагенеза?!

Исходя из этого можно ожидать появления в организме человека и животных антител, обладающих самыми неожиданными ферментативными активностями, гены большей части которых элиминируются в процессе эмбрионального развития. Подтверждением данного предположения служит

672

открытие в организме больных астмой аутоиммунных антител, специфически расщепляющих эндогенно образующийся пептидный гормон – вазоактивный кишечный пептид (VIP). По-видимому, по мере накопления экспериментальных данных число таких примеров будет увеличиваться. На скрытую потенциальную полифункциональность полипептидных цепей указывает также наличие у многих ферментов аллостерической регуляции, проявляющейся в различных формах, разная субстратная специфичность аллельных вариантов различных ферментов, а также изменение субстратной специфичности некоторых ферментов при изменении условий окружающей среды.

Таким образом, при ближайшем рассмотрении традиционное представление о ферментах как о высокоспецифических биологических катализаторах кажется упрощенным. Высокая специфичность ферментов проявляется лишь в определенных условиях внутренней среды организма, как одна из возможностей, детерминированных конкретной первичной структурой данного полипептида. Незначительные изменения первичной структуры таких полипептидных цепей под действием точковых мутаций, по-видимому, могли бы способствовать проявлению скрытых возможностей полипептидных цепей, вызывая появление у них новой субстратной специфичности. Реализация некоторых вновь возникших субстратных специфичностей мутантных ферментов может происходить в клетках в том случае, если для них найдется соответствующий субстрат среди многочисленных нормальных метаболитов и не менее многочисленных макромолекул (что имеет место, в частности, в случае аутоиммунных антител, расщепляющих VIP).

Таким образом, вырисовывается следующая гипотетическая цепь событий, приводящих к образованию ферментов с новой субстратной специфичностью: соматическая мутация изменяет первичную структуру полипептидной цепи какого-либо фермента таким образом, что он начинает распознавать эндогенный метаболит в качестве нового субстрата и метаболизировать его с образованием нового химического соединения, не свойственного данному организму. Эндогенно синтезированному химическому соединению можно было бы присвоить парадоксальное название эндогенного ксенобиотика. Естественно, что мутационное изменение субстратной специфичности ферментов должно быть редким событием. Однако с учетом громадного числа соматических клеток организмов животных и человека, а

673

также вполне значимой частоты спонтанных соматических мутаций (10-8–10-9 и выше на клеточную генерацию) этот механизм может реализовываться.

Возможность такого события должна существенно возрастать из-за увеличения частоты соматических мутаций под действием неблагоприятных экологических факторов. Более того, вышеупомянутые низкие частоты соматических мутаций можно рассматривать только как средние. В разделе 5.3 уже была обоснована дифференциальная защищенность отдельных генетических локусов от химических мутагенов, которая обусловливается особенностями их пространственной структуры в составе хроматина.

Если предположение об образовании эндогенных ксенобиотиков в онтогенезе верно, то подобный процесс должен быть свойственен большинству многоклеточных организмов и носить глобальный характер. В соответствии с этой гипотезой процесс образования эндогенных ксенобиотиков в многоклеточном организме ферментами, субстратная специфичность которых изменена под действием соматических мутаций, можно было бы назвать ксенобиозом. Какими же могут быть последствия ксенобиоза для многоклеточного организма? В качестве единственного примера рассмотрим возможное влияние соматических мутаций на систему цитохрома P-450 в организме человека и животных.

Цитохромы группы P-450 являются одними из основных компонентов обширной системы детоксикации чужеродных химических соединений (ксенобиотиков), поступающих в организм человека и животных из окружающей среды (подробнее см. раздел 5.1.1). Отличительной особенностью системы цитохромов P-450 является их способность распознавать в качестве субстратов и метаболизировать множество экзогенных химических соединений, что, с одной стороны, объясняется наличием большого числа изоформ цитохромов P- 450, а с другой – их широкой субстратной специфичностью.

Среди цитохромов P-450 встречаются изоформы и со строгой субстратной специфичностью. Эти ферменты участвуют в метаболизме эндогенных химических соединений, в частности в биосинтезе стероидных гормонов. Таким образом, налицо противоречивый характер действия цитохромов группы P-450. С одной стороны, они распознают и метаболизируют миллионы ксенобиотиков, а с другой – как правило, не метаболизируют сотни тысяч эндогенных метаболитов. Следовательно, система цитохрома P-450

674

толерантна в отношении эндогенных метаболитов собственного организма, многие из которых обладают большим структурным сходством с экзогенными ксенобиотиками. Каким же образом можно представить себе механизм потери толерантности системы цитохрома Р-450 по отношению к обычным метаболитам соматических клеток, и каковы возможные последствия этого явления? Метаболизм ксенобиотиков цитохромами группы P-450 сопровождается двойственным физиологическим эффектом. Во-первых, как уже упоминалось (см. раздел 5.1.1), происходит детоксикация ксенобиотиков, а во-вторых, их метаболическая активация – образование нестабильных, реакционноспособных промежуточных химических соединений, обладающих мутагенной и канцерогенной активностью. Этот механизм является одним из основных в активации химических проканцерогенов в канцерогены, особенно в случае полициклических ароматических углеводородов.

675

Рис. II.24. Гипотетическая схема ксенобиоза и его последствий

В верхней части рисунка изображены соматическая клетка и происходящие в ней процессы, приводящие к образованию эндогенных ксенобиотиков

При этом можно говорить о возможности нарушения толерантности системы цитохрома Р-450 в результате каких-либо патологических процессов, как это имеет место в случае иммунной системы при развитии аутоиммунных заболеваний. С учетом приведенных фактов можно предполагать, что под действием соматических мутаций может произойти изменение активного

676

центра цитохрома P-450 таким образом, что он начнет распознавать в качестве субстрата эндогенный метаболит организма, например ароматическую аминокислоту или стероидный гормон, и метаболизировать его по эпоксиддиольному пути с образованием промежуточного эпоксида, обладающего мутагенной активностью (рис. II.24). Образовавшийся эндогенный ксенобиотик в том случае, если он не окажется особенно токсичным, будет непрерывно мутагенизировать геном как своей собственной клетки, так и соседних клеток до тех пор, пока не произойдут мутации, нарушающие контроль клеточной пролиферации (например в онкогенах или генах-супрессорах опухолей), что будет сопровождаться малигнизацией клеток, в том числе их неконтролируемым ростом, т.е. развитием злокачественного новообразования.

В том случае, если будет малигнизироваться клетка, содержащая мутантный ген цитохрома P-450, то все клетки образующейся опухоли будут синтезировать эндогенный ксенобиотик и опухоль будет оказывать сильный токсический эффект на целый организм. Этого не произойдет, если будут малигнизироваться клетки, расположенные по соседству с мутантной. В настоящее время уже описаны эксперименты, в которых с помощью направленного введения точковых мутаций удалось изменить специфичность цитохрома P-450. Кроме того, как было упомянуто выше, изменение субстратной специфичности под действием точковых мутаций описано и для других ферментов. Все это указывает на возможность развития событий по предлагаемому гипотетическому сценарию.

Появление мутаторного фенотипа у клеток злокачественных новообразований описано в настоящее время для многих форм рака. Основной причиной мутаторного фенотипа раковых клеток считают мутационные нарушения ферментных систем репарации, что имитирует внутриклеточное возрастание концентрации мутагенов. Предлагаемый механизм указывает на еще один возможный путь малигнизации нормальных клеток через образование эндогенных ксенобиотиков – эндогенных мутагенов. При развитии такой цепи событий повреждение систем репарации будет вторичным по отношению к первичному синтезу эндогенного мутагена.

Помимо онкологических заболеваний эндогенные ксенобиотики могли бы вызывать некоторые аутоиммунные заболевания в ответ на образование аддуктов с макромолекулами организма, что придавало бы модифицированным

677

макромолекулам иммуногенность и нарушало иммунологическую толерантность организма. Эндогенные ксенобиотики могли бы быть также одной из постоянно действующих причин старения организма вследствие его постепенного отравления эндогенными ксенобиотиками по мере накопления в клетках с возрастом мутантных ферментов, обладающих измененной субстратной специфичностью.

Процесс спонтанного и индуцированного соматического мутагенеза происходит непрерывно на протяжении всей жизни многоклеточного организма. Следовательно, в организме постоянно образуются новые мутантные белки, которые исходно не были закодированы его геномом. Мутантные белки могут контактировать в клетках с большим количеством эндогенных метаболитов и при наличии структурного соответствия между метаболитом и новым активным центром мутантного белка метаболизировать его с образованием эндогенного ксенобиотика, например продуктов расщепления упомянутого выше пептидного гормона VIP, наличие которых в организме больных доказано. Многоклеточный организм является своеобразным полигоном, на котором ежеминутно на протяжении всей жизни происходят испытания вновь образующихся белков на способность метаболизировать эндогенные химические соединения, с которыми они находятся в контакте. Таким образом, ксенобиоз в том случае, если он распространен так широко, как я думаю, должен быть обычным феноменом, присущим всем многоклеточным организмам.

Если предположение о ксенобиозе верно, то организм должен обладать эффективными системами защиты от этого неизбежного явления. Помимо высокоэффективных репаративных систем, понижающих частоту спонтанного мутагенеза в соматических клетках, защиту от эндогенных ксенобиотиков отчасти могла бы осуществлять сама иммунная система. В таких случаях с участием иммунной системы элиминировались бы те мутантные соматические клетки, которые экспонируют мутантные белки на своей поверхности и которые в этом случае распознавались бы как чужеродные антигены. Однако в большинстве случаев, по-видимому, этого не должно происходить, так как мутантные белки будут локализованы внутри клеток.

Другим средством защиты от образующихся ферментов с новой субстратной специфичностью (и ксенобиоза) у многоклеточных организмов могут быть убиквитин- и ATP-зависимые системы внутриклеточного протеолиза

678

аномальных белков. Однако эти системы должны срабатывать в первую очередь в отношении мутантных белков, у которых резко нарушена пространственная структура, что при одиночных заменах аминокислот, повидимому, происходит редко. В пользу такого предположения свидетельствуют все те многочисленные мутантные соматические клетки, которые описаны в литературе и из которых можно выделять мутантные белки.

Вероятно, основную защиту от эндогенных ксенобиотиков могла бы обеспечивать обсуждавшаяся выше система цитохрома P-450. Действительно, широкая совокупная субстратная специфичность системы цитохрома P-450 позволяет ей метаболизировать и в конечном счете обезвреживать химические соединения. По аналогии с иммунной системой, которая помимо защиты организма от экзогенных инфекционных агентов выполняет функции иммунного надзора за антигенным состоянием соматических клеток, основной функцией системы цитохрома P-450 может быть освобождение организма от эндогенных ксенобиотиков. В соответствии с этим система цитохрома P-450 эволюционно могла возникнуть для поддержания, прежде всего, метаболического гомеостаза многоклеточных организмов в условиях непрерывно образующихся эндогенных ксенобиотиков, а уже затем ее функции распространились и на экзогенные химические соединения, вредные для организма.

679

ГЛАВА 9. АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК, РИБОЗИМЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗИМЫ

Антисмысловые РНК как ключевые компоненты одной из систем негативной регуляции экспрессии генов были впервые описаны у бактерий. Вскоре тот же тип регуляции был обнаружен и у эукариот. Уже в первых опытах было установлено, что короткие РНК, комплементарные мРНК, образуют с ними гибриды и блокируют трансляцию. Поскольку действие таких РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, они получили название антисмысловых (antisense RNA), или micРНК (mRNA interfering complementary RNA). Это открытие вскоре легло в основу целого направления исследований искусственной регуляции экспрессии генов, неразрывно связанного с методами генной инженерии.

9.1. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды

Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с образованием двухцепочечных РНК–РНК- или ДНК–РНК-гибридов. Оказалось, что взаимодействие с мРНК комплементарного ей полинуклеотида или олигонуклеотида (которые могут быть транскриптами незначащей цепи ДНК, т.е. противоположной той, с которой произошла транскрипция этой мРНК) может блокировать ее трансляцию рибосомами и нарушать экспрессию всего гена на уровне трансляции.

В середине 1970-х годов синтетические олигонуклеотиды, комплементарные мРНК, были впервые использованы в бесклеточных системах биосинтеза белка для подавления трансляции этих мРНК. С разработкой современных методов генной инженерии получение антисмысловых РНК упростилось, так как достаточно в экспрессирующем векторе поместить кодирующую последовательность гена в обратной ориентации по отношению к промотору, чтобы начала транскрибироваться незначащая цепь ДНК с образованием антисмысловой РНК. В такой системе с использованием современных векторов, в которых клонируемая

680

последовательность фланкирована промоторами T3-, T7или SP6-РНК- полимераз (например вектор Bluescript, см. рис. II.5), можно синтезировать большое количество антисмысловых РНК и использовать их в высокоочищенном состоянии в опытах in vitro. Однако современные генноинженерные конструкции позволяют вводить векторные молекулы, экспрессирующие антисмысловые РНК, непосредственно в клетки живых организмов и наблюдать биологические эффекты антисмысловых РНК в результате их эндогенной экспрессии.

9.1.1. Механизм действия антисмысловых РНК

Многочисленные исследования антисмысловых РНК как in vitro, так и in vivo показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК которых является мишенью действия антисмысловых РНК. При использовании олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным частям мРНК, было установлено, что как в бесклеточных экстрактах, так и в эукариотических клетках подавление трансляции мРНК достигалось главным образом за счет ее расщепления РНКазой H в месте образования РНК–ДНК-гибрида. При этом бесклеточные экстракты зародышей пшеницы были особенно богаты РНКазой H, однако процесс специфического расщепления мРНК эффективно происходил и в ооцитах Xenopus, и в культивируемых клетках животных. Интересным следствием такого рода исследований оказалось то, что даже экзогенно добавленные к культивируемым клеткам олигодезоксирибонуклеотиды проникали внутрь клеток и блокировали трансляцию соответствующих мРНК.

Механизм транспорта олигонуклеотидов в клетки обладает чертами сходства с эндоцитозом, опосредованным рецепторами. Эффект подавления трансляции мРНК специфическими комплементарными нуклеотидами достигался, как правило, лишь при большом молярном избытке олигонуклеотидов по отношению к мРНК, что является следствием их относительно медленной реассоциации и быстрой внутриклеточной деградации олигонуклеотидов (время полужизни в ооцитах менее 20 мин). Расщепление гибридов мРНК с олигодезоксирибонуклеотидами – не единственный механизм ингибирующего действия олигонуклеотидов на трансляцию. Использование