Экспрессия генов Патрушев

661

использованы против клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены.

Рис. II.23. Использование гибридного белка для регуляции экспрессии гена

Методы генной инженерии открывают безграничные возможности конструирования новых белков путем объединения в разных комбинациях различных функциональных доменов полипептидных цепей. Получение гибридных токсинов направленного действия иллюстрирует возможности такого подхода в белковой инженерии. В качестве последней иллюстрации возможностей этой группы методов рассмотрим гибридный белок как новый регулятор активности генов. При конструировании такого белка методами генной инженерии был заменен ДНК-связывающий домен в рецепторе глюкокортикоидных гормонов на соответствующий домен LexA-репрессора

E. coli (рис. II.23).

Введение операторной последовательности гена lexA в область промотора глобинового гена (или других генов) приводило к активации промотора под действием гибридного белка в присутствии дексаметазона – синтетического гормона, взаимодействующего с рецептором глюкокортикоидов. Таким образом, в новом генетическом окружении последовательность нуклеотидов оператора гена lexA E. coli функционировала в качестве энхансера транскрипции в присутствии гибридного белка-активатора, узнающего эту последовательность. Результаты работы демонстрируют возможность

662

создания новых белков – регуляторов активности генов путем комбинирования известных функциональных доменов.

Развитие белковой инженерии во многом сдерживается недостатком знания о структурно-функциональных взаимоотношениях в белках, что обусловлено сложностью объекта исследования. Многочисленные работы, направленные на изучение таких связей, как правило, носят эмпирический характер и завершаются локализацией аминокислот, существенных для функционирования активных центров ферментов. Поэтому основная задача белковой инженерии – по известной последовательности аминокислотных остатков получить белок с заданными свойствами – в настоящее время еще далека от своего разрешения. Тем не менее, уже сейчас иногда удается целенаправленно изменять некоторые свойства существующих ферментов путем замен небольшого числа аминокислотных остатков их полипептидных цепей с помощью направленного мутагенеза.

8.2.4. Подходы к созданию новых ферментов

Подавляющее большинство исследований, в которых методы белковой инженерии используют для замен отдельных аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков, заканчиваются получением мутантных производных, у которых отсутствует, резко ослаблена или остается неизменной исходная ферментативная активность. В таких опытах обычно локализуют отдельные остатки аминокислот, участвующих в формировании активных центров ферментов. Однако в ряде случаев методами направленного мутагенеза удается целенаправленно и кардинально изменять свойства белков. В опытах такого рода можно повысить термостабильность исследуемых белков, усилить их устойчивость по отношению к окислению, протеолизу и другим неблагоприятным воздействиям, а также изменить у исходных ферментов субстратную специфичность.

Серия работ была проведена на субтилизине – протеолитическом ферменте бактерий рода Bacillus. В активном центре субтилизина B. lentus в положении 222 находится метионин. Окисление Met-222 сопровождается образованием соответствующего сульфоксида и полностью инактивирует фермент. Методом направленного мутагенеза произвели замену Met-222→Cys

663

и остатки цистеина модифицировали тиоалкилирующим агентом. Это делало фермент высокоустойчивым к окислению и сопровождалось лишь незначительной потерей его активности. Новые свойства модифицированного субтилизина расширяют возможности его применения в биотехнологии. Путем замены отдельных аминокислотных остатков субтилизина в других работах удавалось изменять его субстратную специфичность, повышать удельную активность, изменять оптимум pH и увеличивать устойчивость по отношению к щелочи.

Эти работы иллюстрируют возможности данного направления исследований в белковой инженерии, направленных на создание высокотехнологичных ферментов, способных длительное время функционировать в жестких условиях ферментации на промышленных установках. На еще одно направление развития исследований в белковой инженерии указывают работы по направленному изменению субстратной специфичности ферментов путем замены отдельных аминокислотных остатков в их полипептидных цепях. Например, замена Met-73 у ингибитора субтилизина Streptomyces lividans на Lys или Arg приводила к появлению у него способности ингибировать трипсин. При этом у мутантного ингибитора с заменой Met73→Lys появлялась также способность ингибировать лизилэндопептидазу, а

ингибитор с заменой Met-73 на Tyr или Trp подавлял активность α- трипсиногена. Исследования продемонстрировали функциональную значимость остатка Met-73 в так называемом PI-сайте участка полипептидной цепи, контактирующего с ингибируемыми ферментами, и позволили создать модель такого белок-белкового взаимодействия. Кроме того, эти работы являются основой для конструирования новых ингибиторов сериновых протеиназ, а также более глубокого изучения механизма их ингибирующего действия.

Такой же подход с целенаправленными заменами отдельных аминокислотных остатков был использован для изменения субстратной специфичности трипсина. В этом случае предварительный теоретический анализ структурных особенностей активного центра трипсина и особенно его субстрат-связывающего участка позволил предсказать аминокислотные остатки, существенные для взаимодействия субстрата с ферментом и обеспечивающие специфичность его действия. Проведенная на основании

665

одного из двух основных подходов к созданию методами белковой инженерии белков с новыми каталитическими активностями. Такой подход заключается в изменении существующих активных центров ферментов путем замен отдельных аминокислотных остатков, которые участвуют в формировании активных центров. Принципиально другой подход к получению ферментов новой специфичности заключается в модификации методами белковой инженерии биологических рецепторов путем введения каталитических функциональных групп в центры связывания лигандов-субстратов. Такой подход был, в частности, реализован при конструировании методом направленного мутагенеза каталитических антител – абзимов.

Была поставлена задача методами белковой инженерии на основе иммуноглобулинов, специфически взаимодействующих с динитрофенильными группами антигенов, получить абзимы, гидролизующие эфиры динитрофенола следующей структуры:

Исходя из того, что имидазол действует в качестве нуклеофильного катализатора при гидролизе карбоксиэфиров в водных растворах, предполагали, что введение остатка гистидина в центр связывания динитрофенильных лигандов иммуноглобулина может придать ему способность осуществлять гидролиз сложных эфиров динитрофенола. В качестве исходного белка при конструировании абзима использовали VL- и VH-фрагменты тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, специфически взаимодействующего с динитрофенильными группами антигенов. VL- и VH-фрагменты представляют собой вариабельные области иммуноглобулина, которые взаимодействуют с антигеном. Фрагмент ДНК, кодирующий VL-область легкой цепи, синтезировали in vitro и экспрессировали в клетках E. coli. При этом в процессе синтеза кодон, кодирующий Tyr-34, был изменен на кодон His, так как было известно, что именно Tyr-34 контактирует с молекулами динитрофенола в комплексах антиген–антитело. Очищенный рекомбинантный VL-фрагмент объединяли с VH-

666

фрагментом тяжелой цепи природного иммуноглобулина, взаимодействующего с динитрофенолом, что приводило к образованию так называемого Fvфрагмента.

Оказалось, что такой мутантный Fv-фрагмент способен катализировать гидролиз кумаринового эфира 5-(2,4-динитрофенил)аминопентаноевой кислоты (см. выше структурную формулу, n=4) в 90 000 раз более эффективно, чем 4- метилимидазол, и начальная скорость гидролиза была в 45 раз выше, чем у Fvфрагмента дикого типа. При этом мутантный Fv-фрагмент был неактивен в отношении аминопропаноевого (n=2) и аминогексаноевого (n=5) аналогов субстрата. Таким образом, с помощью замены единственной аминокислоты в антигенсвязывающем центре иммуноглобулина удалось создать на его основе высокоспецифичный гидролитический фермент, а сам процесс его конструирования был основан на знании молекулярных механизмов катализа и взаимодействия антигенов с антителами.

Внастоящее время реализованы оба подхода к созданию искусственных ферментов с новыми субстратными специфичностями, основанные на изменении отдельных аминокислотных остатков в субстратили лигандсвязывающих центрах ферментов или рецепторов. По мере углубления знаний о механизмах действия ферментов и закономерностей реализации потенций первичной структуры полипептидных цепей в их пространственной структуре появится возможность конструирования абсолютно новых белков с заданной ферментативной активностью. С этого момента значительно расширится поле деятельности белковой инженерии, которая вместе с генной инженерией сможет решать задачи, связанные с целенаправленным изменением уже известных и созданием новых метаболических путей в клетках живых организмов.

8.2.5.Субтилигаза в лигировании пептидов

Взаключение рассмотрим еще одно неожиданное направление белковой инженерии, четко обозначившееся в самое последнее время. Во всех вышеупомянутых подходах конструирование белков с новыми свойствами основано на использовании молекулярно-генетических методов направленного мутагенеза. К сожалению, все эти методы обладают одним существенным недостатком: с их помощью невозможно осуществить встраивание в

667

исследуемые полипептидные цепи многих неприродных аналогов аминокислот или других химических соединений, что весьма существенно ограничивает возможности структурно-функциональных исследований белков. Такие модификации можно было бы вносить в процессе химического синтеза пептидов, однако в этом случае невозможно получать пептиды большой длины (как правило, >40 остатков аминокислот) из-за накопления побочных продуктов синтеза, что затрудняет последующую очистку основного продукта и снижает выход пептидов.

Недавно был разработан альтернативный подход к химическому синтезу длинных пептидов, заключающийся в ферментативном лигировании предварительно синтезированных химическими методами коротких пептидов друг с другом. Этот подход стал возможен благодаря созданию с помощью направленного мутагенеза аналога субтилизина, так называемого субтилизина BPN’, катализирующего образование пептидных связей в водных растворах. Такой мутантный фермент, получивший название субтилигазы, содержит в своей полипептидной цепи две мутационные замены: Ser заменен на остаток Cys, а Pro – на Ala. Первая замена в активном центре субтилизина резко повышает его способность к аминолизу (т.е. образованию пептидной связи) по сравнению с гидролитической активностью при использовании в качестве субстратов тетрапептидных эфиров. Вторая мутация изменяет конформацию мутантного активного центра, компенсируя стерические эффекты, вызванные введением остатка Cys, что еще более улучшает каталитические свойства фермента.

Д. Джексоном с соавторами (1994 г.) разработана стратегия синтеза крупных полипептидных цепей с использованием субтилигазы, реализованная в синтезе модифицированной рибонуклеазы А, обладающей ферментативной активностью. На первом этапе синтеза был получен полностью незащищенный пептид, представляющий собой C-концевой фрагмент РНКазы А, и он был использован в дальнейшем в качестве акцепторной молекулы (см. схему).

R-NH-пептидY-CO-R’ + H2N-пептидZ-COOH

↓ 1. Субтилигаза

R-NH-пептидY-CO-NH-пептидZ-COOH

668

↓ 2. Zn/CH3COOH

H2N-пептидY-CO-NH-пептидZ-COOH

R-NH-пептидX-CO-R’ ↓ 3. Повторение этапов 1 и 2

H2N-пептидX-CO-NH-пептидY-CO-NH-пептидZ-COOH

Следующий N-концевой донорный фрагмент полипептидной цепи этерифицирован по С-концу гликолат-фенилаланиламидом (glc-F-NH2). Полученный эфир эффективно ацилируется субтилигазой, что отражает особенности ее субстратной специфичности: фермент предпочитает использовать в качестве субстрата эфиры, в которых освобождается группа glc- F-NH2. В отличие от этого донорный пептид содержит на N-конце дополнительную изоникотиноильную защитную группу, что предотвращает его лигирование самого на себя. Такая группа вводится на последней стадии твердофазного синтеза пептидов и проявляет устойчивость к разбавленной плавиковой кислоте (HF), которая использовалась для снятия защиты с боковых цепей пептидов и отщепления самих пептидов от твердого носителя. После каждого лигирования пептидов изоникотиноильную группу удаляли в условиях мягкого восстановления (в присутствии цинка и уксусной кислоты) для освобождения NH2-группы – необходимой участницы очередного цикла лигирования.

Исходя из субстратной специфичности субтилигазы (фермент эффективно использует крупные гидрофобные донорные субстраты и

669

малоэффективен с отрицательно заряженными остатками аминокислот или остатками пролина, попадающими в его активный центр), карту полипептидной цепи РНКазы А разделили на шесть фрагментов. Эти фрагменты были синтезированы и лигированы друг с другом в соответствии с вышеприведенной схемой с выходом, достигающим 70% на каждом этапе. В результате была получена полноразмерная полипептидная цепь РНКазы А (124 аминокислотных остатка), которая после спонтанного фолдинга приобрела искомую ферментативную активность. В ходе синтеза отдельных пептидов исследователи заменили два остатка His, находящихся в активном центре фермента (положения 12 и 119), на остатки 4-фторгистидина. Поскольку это производное His обладает pKa = 3,5 (pKa His = 6,8), у искусственной РНКазы А наблюдали резкий сдвиг в оптимуме pH реакции гидролиза субстрата без заметных изменений kкат, что было особенно неожиданным результатом, позволившим сделать интересные выводы о механизме ферментативной реакции, осуществляемой РНКазой А. Позднее субтилигаза была успешно использована для синтеза модифицированного гормона роста человека и циклических пептидов.

Значение результатов, полученных в ходе направленного изменения субстратной специфичности субтилизина, превратившегося в субтилигазу, выходит далеко за рамки чисто прикладного использования нового искусственного фермента. Это и многие другие подобные исследования, осуществленные методами белковой инженерии, однозначно указывают на возможность изменения субстратной специфичности известных ферментов путем замены в них одного или нескольких критических аминокислотных остатков. Такого рода результаты, примеры которых уже были приведены выше и более подробно будут рассмотрены в следующем разделе, приподнимают завесу над механизмами молекулярной эволюции метаболических путей живого организма, лежащих в основе его существования. История развития молекулярной биологии и генетики показывает, что практически любой неизвестный в природе механизм, разработанный и реализованный исследователем в физиологических условиях в пробирке, уже используется in vivo в существующих генетических системах. Однажды на семинаре, когда кто-то пытался выдать банальность за новую информацию, Р.Б. Хесин сказал: "Это новость только для того, кто не читает научной литературы". Мы записаны

670

в библиотеку Природы, однако, несмотря на все усилия, в настоящее время в состоянии читать на разных языках только букварь, написанный под ее диктовку. Вся область белковой инженерии, которая, на первый взгляд, кажется блестящим порождением лишь одного интеллекта человека, не есть исключение, поскольку ферменты с новой субстратной специфичностью могут быть результатом точковых мутаций, непрерывно происходящих в геноме любого живого организма. А следовательно, Природа непрерывно конструирует новые белки и отбирает лучшие варианты с самого момента возникновения жизни на Земле. И этот процесс ежеминутно происходит в биосфере, в том числе и в онтогенезе эукариот.

8.3. Концепция ксенобиоза

Успехи белковой инженерии, демонстрирующие возможность изменения субстратной специфичности ферментов путем замены одной или нескольких аминокислот с помощью направленного мутагенеза, наводят на многочисленные размышления. В частности, возникает вопрос: почему изменения субстратной специфичности ферментов являются редким событием, а мутации в конкретном гене, как правило, сопровождаются ослаблением или потерей ферментативной активности вообще? В силу ограниченности наших знаний о структурно-функциональных взаимоотношениях в белках ответ на такой вопрос кажется очевидным: одиночные замены аминокислот в активном центре фермента или его окрестностях приводят к конформационным или иным изменениям полипептидной цепи, делающим активный центр нефункциональным в отношении своего природного субстрата.

Вероятно, на самом деле последствия таких мутационных замен аминокислот могут быть более значительными. Начнем с того, что внимание исследователей, изучающих свойства мутантных ферментов, как правило, целиком направлено на изучение влияния мутаций на его основную активность. При этом не учитывается возможность появления новой ферментативной активности, которая остается незамеченной просто потому, что исходно неизвестно, появления какой активности следует ожидать. А между тем при ближайшем рассмотрении такие последствия почти любой миссенс-мутации (точковой мутации, которая приводит к замене одного осмысленного кодона на другой) в структурной части гена, кодирующего полипептидную цепь, кажутся