Экспрессия генов Патрушев

651

Рис. II.20. Схема конструирования рекомбинантного вирусного генома, содержащего вставки вырожденных олигонуклеотидов, для получения библиотеки эпитопов

Двухцепочечный олигонуклеотид (а), содержащий вырожденные кодоны NNK и те же самые сайты рестрикции в составе линкеров, лигируют с ДНК вектора Fuse5 (б), расщепленного рестриктазой SfiI, с образованием рекомбинантного генома (в), который направляет синтез гибридного рекомбинантного белка (г), содержащего на N-конце указанную аминокислотную последовательность

При конструировании библиотеки пептидов прежде всего синтезируют два комплементарных друг другу олигонуклеотида, которые после отжига образуют двухцепочечную молекулу, центральная часть которой кодирует собственно пептиды (рис. II.20,а), а выступающие по концам одноцепочечные участки комплементарны "липким" концам вектора, получающимся под действием соответствующей рестриктазы (см. рис. II.20,б).

Для кодирования аминокислот пептидов используют вырожденные кодоны вида NNK или NNS, которые включают все четыре нуклеотида (N) в первом и втором положениях, G или T (K), а также G или С (S) в третьем положении. При таком подходе информация о всех 20 аминокислотах и одном стоп-кодоне заключена в 32 различных кодонах NNK и NNS, а не в 64, как это имеет место в случае природного генетического кода.

В процессе синтеза вырожденных олигонуклеотидов, кодирующих исследуемые пептиды, на каждой стадии используют индивидуальные нуклеотиды для кодонов инвариантных аминокислот, фланкирующих

652

вариабельный участок пептида, а также эквимолярные смеси нуклеотидов для участков, кодирующих случайные последовательности. Образовавшийся в итоге набор вырожденных олигонуклеотидов далее клонируют в виде одноцепочечных фрагментов в соответствующих сайтах гена белка оболочки бактериофага в составе фагового вектора или фазмиды. Альтернативно для такого набора олигонуклеотидов (химически или с помощью ПЦР) синтезируют комплементарные цепи с включением инозина в вариабельные участки, поскольку его остатки, как известно, спариваются с основаниями С и T матрицы, что облегчает образование правильных дуплексов между соответствующими олигонуклеотидами. Образующиеся двухцепочечные олигонуклеотиды в случае необходимости обрабатывают соответствующими рестриктазами и клонируют в фаговом векторе. Итоговые рекомбинантные молекулы (см. рис. II.20,в) ДНК вводят в бактериальные клетки, получая ~109 трансформантов на 1 мг рекомбинантной ДНК, образовавшиеся фаговые частицы размножают в бактериях и после очистки исследуют на присутствие рекомбинантных пептидов (см. рис. II.20,г), способных взаимодействовать с исследуемыми рецепторами в белках их вирионов.

Число индивидуальных фаговых клонов в библиотеке является определяющим для ее использования. К примеру, библиотека, заключающая в себе все возможные гексапептиды, должна содержать 64 млн (206) разных шестичленных аминокислотных последовательностей, кодируемых ~1 млрд (326) различных гексакодонов (32 – число кодонов, с помощью которых можно закодировать любую из 20 аминокислот предложенным выше способом, а именно с использованием кодонов NNK или NNS). Для решения такой задачи должны быть получены очень большие библиотеки, содержащие, по крайней мере, 2·108 – 3·108 индивидуальных, независимых клонов, а величина 109 в настоящее время является верхним пределом для числа индивидуальных клонов библиотеки, которую еще можно практически использовать.

Исходя из этого, можно заключить, что максимальная длина пептидов, включающих в себя все возможные сочетания 20 аминокислот, с которыми возможно работать с помощью библиотек пептидов, составляет 6 аминокислотных остатков. Тем не менее, следует иметь в виду, что библиотека 15-членных пептидов того же размера (2–3·108 клонов) будет содержать больше разнообразных гексапептидов, чем рассмотренная выше библиотека 6-

653

членных пептидов. Кроме того, поскольку лишь ограниченное число аминокислотных остатков в пептиде действительно определяет его биологическую активность, библиотека 15-членных пептидов может оказаться представительнее библиотеки более коротких пептидов с тем же числом клонов.

Рис. II.21. Схема отбора фаговых частиц, обладающих требуемыми эпитопами

Показаны три рекомбинантных фаговых частицы, экспрессирующие разные эпитопы в составе pIII. Только эпитоп центральной фаговой частицы распознается молекулой биотинилированного антитела, иммобилизованного на чашке Петри с помощью стрептавидина и использованного для скрининга библиотеки

Для того чтобы выделить из библиотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. В частности, для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина (рис. II.21). Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, взаимодействуют с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие рекомбинантные фаговые частицы

654

удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы далее элюируют кислотой, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактериальных клетках и экспрессированные на них эпитопы исследуют по различным критериям. Наличие идентичных или сходных последовательностей нуклеотидов среди клонированных последовательностей свидетельствует о специфичности процесса очистки. Индивидуальные клоны затем охарактеризовывают другими, в частности иммуноферментными методами. На заключительной стадии исследования осуществляют синтез выделенных пептидов и их всестороннее изучение в очищенном состоянии.

Внастоящее время имеются данные о некоторых работах, проведенных

сиспользованием пептидных библиотек. В одном из таких исследований из библиотеки были выделены пептиды, последовательность аминокислот в которых резко отличалась от последовательности аминокислот истинного эпитопа исследуемого антигена. Тем не менее, такой пептид прочно связывался со специфическими антителами и конкурировал за связывание с природным антигеном. Это позволило сделать вывод о возможности существования мимотопов – коротких пептидов, имитирующих природные эпитопы, последовательности аминокислот которых существенно различаются между собой. Удалось установить канонические последовательности аминокислот пептидов, имитирующих эпитопы природных белков, а среди них идентифицировать аминокислотные остатки, играющие ключевую роль во взаимодействии антиген–антитело.

Одним из многообещающих приложений библиотек пептидов является идентификация пептидных лигандов, имитирующих "структурные" эпитопы, образующиеся на поверхности белковых глобул в результате сворачивания их полипептидных цепей, что сопровождается пространственным сближением аминокислотных остатков, расположенных в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга. С помощью пептидных библиотек возможна идентификация пептидных аналогов различных эпитопов небелковой природы. По-видимому, в ближайшем будущем возможно использование пептидных библиотек для получения новых лекарственных препаратов, создания диагностических средств и производства эффективных вакцин. В области конструирования новых лекарственных препаратов усилия исследователей могли бы быть направлены на создание пептидных лигандов,

655

специфически взаимодействующих с рецепторами, представляющими медикобиологический интерес. Знание структуры таких лигандов позволило бы упростить получение на этой основе лекарственных препаратов небелковой природы.

Библиотеки пептидов и эпитопов найдут свое применение и в исследованиях механизмов гуморального иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы. В частности, большинство аутоиммунных заболеваний сопровождается образованием аутоантител против антигенов собственного организма. Эти антитела во многих случаях служат специфическими маркерами того или иного аутоиммунного заболевания. С использованием библиотеки эпитопов, в принципе, можно получить пептидные маркеры, с помощью которых было бы возможно следить за специфичностью аутоантител во время развития патологического процесса как в индивидуальном организме, так и в группе пациентов и, кроме того, определять специфичность аутоантител при заболеваниях неизвестной этиологии.

Библиотеки пептидов и эпитопов потенциально могут быть использованы также для скрининга иммунных сывороток с целью выявления пептидов, специфически взаимодействующих с защитными антителами. Такие пептиды будут имитировать антигенные детерминанты патогенных организмов и служить мишенями для защитных антител организма. Это позволит использовать подобные пептиды для вакцинации пациентов, у которых отсутствуют антитела против соответствующих патогенов. Изучение эпитопов с помощью библиотек пептидов является частным случаем одного из многочисленных направлений их использования в прикладных и фундаментальных исследованиях взаимодействия лигандов и рецепторов. Дальнейшее усовершенствование этого подхода должно способствовать созданию новых лекарственных препаратов на основе коротких пептидов и быть полезным в фундаментальных исследованиях механизмов белокбелковых взаимодействий.

8.2.2.Белки-репортеры в гибридных белках

Врассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.

656

В другом случае гибридные белки применяют для получения высокого уровня экспрессии коротких пептидов в бактериальных клетках благодаря стабилизации этих пептидов в составе гибридных белков. Часто гибридные белки используют для идентификации и очистки трудноопределяемых рекомбинантных белков. Например, присоединив к С-концу исследуемого белка в качестве белка-репортера β-галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности β-галактозидазы, определяя ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединяя фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, можно очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Полученные антитела далее применяют для очистки нативного белка, в состав которого входит рекомбинантный полипептид, кодируемый ОРС, и тем самым идентифицируют клонированный фрагмент гена.

С помощью гибридных белков решают и обратную задачу клонирования неизвестного гена, к белковому продукту которого имеются антитела. В таком случае конструируют клонотеку последовательностей нуклеотидов, представляющих ОРС неизвестных генов, в векторах, которые позволяют соединять клонируемую ОРС в одной рамке считывания с геном-репортером. Образующиеся в результате экспрессии этих рекомбинантных генов гибридные белки идентифицируются с помощью антител иммуноферментными методами. Гибридные гены, объединяющие секретируемые белки и белки-репортеры, дают возможность по-новому исследовать механизмы секреции, а также локализацию и перемещение в тканях секретируемых белков.

8.2.3. Гибридные токсины

Серия работ И. Пастана с сотрудниками по конструированию гибридных токсинов направленного действия прекрасно иллюстрирует возможности белковой инженерии в части комбинирования различных функциональных доменов белков для достижения конкретных биологических эффектов.

657

Рис. II.22. Лекарственные препараты направленного действия на основе гибридных токсинов

а – обобщенная схема структуры лекарственного препарата направленного действия; б – строение псевдомонадного токсина (цифрами обозначено положение аминокислотных остатков); в – строение гибридного токсина; г – гибридный токсин на основе моноклональных антител

Идеальное лекарственное средство строго специфического избирательного действия должно обладать, по крайней мере, следующими структурно-функциональными особенностями (рис. II.22,а). Такой лекарственный препарат должен заключать в себе действующее начало для достижения физиологического эффекта и лиганд, распознающий рецептор на поверхности клеток-мишеней. Кроме того, в нем должны быть структурные элементы, распознаваемые системой транспорта организма, для доставки лекарства к клеткам-мишеням, а также спейсерный участок, необходимый для отделения действующего начала от остальных функциональных частей препарата после его доставки по адресу. Именно такая идеальная схема реализуется в природном экзотоксине Pseudomonas aeruginosa. Экзотоксин А P. aeruginosa представляет собой белок, состоящий из одной полипептидной цепи длиной в 613 аминокислот, которая организована в три функциональных домена (см. рис. II.22,б). N-Концевой домен Ia (аминокислотные остатки 1–252) необходим для взаимодействия с поверхностью клеток-мишеней (прототип лиганда идеального лекарства направленного действия). Функции домена Ib

658

(аминокислотные остатки 365–404) в настоящее время неизвестны. Домен II (аминокислотные остатки 253–364) обеспечивает эффективный перенос токсина в цитозоль клеток (система транспорта лекарства), а домен III (аминокислотные остатки 405–613) осуществляет ADP-рибозилирование фактора элонгации трансляции EF2, что приводит к подавлению трансляции и гибели клеток-мишеней. Таким образом, для оказания цитотоксического действия экзотоксину A необходимо с помощью домена Iа распознать рецепторы на поверхности клеток, проникнуть в клетку с помощью эндоцитоза, опосредованного рецепторами, и быть транслоцированным через внутреннюю мембрану в цитозоль, где локализуется фактор EF2. Основная идея в создании токсинов направленного действия заключалась в том, чтобы заменить домен Iа на какой-либо иной пептидный лиганд, взаимодействующий с другой группой рецепторов на поверхности клеток, и тем самым изменить специфичность действия токсина в отношении самих клеток (см. рис. II.22,в).

Было установлено, что удаление домена Iа генно-инженерными методами резко (в сотни и тысячи раз) снижает токсичность такого укороченного белка как в отношении клеток различных линий, так и in vivo. Присоединение к С-концевой части укороченного полипептида молекулы интерлейкина 2 человека осуществляли путем объединения структурных частей соответствующих генов в экспрессирующем векторе. Очищенный гибридный токсин оказался чрезвычайно токсичным в отношении клеток, несущих на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, и не действовал на клетки, у которых эти рецепторы отсутствовали и которые погибали под действием природного токсина. Интернализация (транслокация внутрь клеток) гибридного токсина была опосредована субъединицами р55 и р70 рецептора интерлейкина 2. Таким образом, в результате действия гибридного токсина на популяцию клеток, часть из которых экспрессирует на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, происходит избирательная гибель именно этих клеток.

В организме большинство покоящихся T-клеток и T-клеток памяти не экспрессируют на своей поверхности высокоаффинных рецепторов интерлейкина 2, тогда как T-клетки, стимулированные аллоантигенами, содержат такие рецепторы. Поэтому внутрибрюшинное введение гибридного токсина крысам с экспериментальным артритом – заболеванием,

659

обусловленным патологической активацией T-клеток, снижало симптомы заболевания. Гибридный токсин существенно уменьшал у мышей и реакции отторжения трансплантата.

Вслед за этими пионерскими работами последовала целая серия исследований, направленных на создание аналогичных систем адресной доставки различных цитотоксических полипептидов. В процессе дальнейшего усовершенствования системы адресной доставки псевдомонадного токсина с использованием интерлейкина 2 в качестве лиганда отказались от полного удаления адресного домена токсина и ограничились его инактивацией путем введения в ген токсина четырех сайт-специфических мутаций. Молекулы такого гибридного токсина оказались в 10–100 раз более эффективными цитотоксическими агентами против клеток человека и обезьян, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы для интерлейкина 2, а также обладали значительно большим временем полужизни в крови мышей in vivo по сравнению с ранее полученной конструкцией.

На основе псевдомонадного токсина были созданы гибридные токсины, содержащие в качестве лигандов полипептидные цепи интерлейкина 4, интерлейкина 6, трансформирующего фактора роста типа α и инсулиноподобного фактора роста I. Для всех этих гибридных белков была показана высокоспецифическая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток (включая клетки миеломы человека), обладающих соответствующими рецепторами. Использование в гибридном токсине в качестве лиганда части полипептидной цепи CD4 – гликопротеина поверхности T-клеток, который является рецептором вируса ВИЧ и взаимодействует с его гликопротеином gp120, позволило избирательно поражать T-клетки, зараженные вирусом ВИЧ и экспрессирующие на своей поверхности вирусный белок gp120.

Тот же принцип подавления инфекции, вызванной вирусами ВИЧ, растворимыми рецепторами CD4 был использован при конструировании гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей CD4 с константными частями тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов человека. При этом в процессе объединения генов были удалены последовательности нуклеотидов, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены CD4, а также вариабельную часть полипептидных цепей иммуноглобулинов. Образующиеся гибридные молекулы, названные иммуноадгезинами, за счет

660

константной части молекулы иммуноглобулина приобретали повышенную стабильность в организме и, кроме того, сохраняли специфические свойства, опосредуемые константными частями иммуноглобулинов: связывание Fсрецептора и белка A, способность к фиксации комплемента и перенос через плацентарный барьер. Совокупность всех этих свойств давала возможность иммуноадгезинам эффективно прерывать инфекцию T-клеток вирусом ВИЧ-I, блокируя как сам вирус, так и зараженные им клетки, экспрессирующие на своей поверхности вирусный антиген gp120.

Дальнейшее усовершенствование генно-инженерных конструкций на основе псевдомонадного экзотоксина А произошло после того, как в качестве адресной части гибридного токсина стали использовать вариабельные домены моноклональных антител к компоненту p55 рецептора интерлейкина 2 человека. В этом рекомбинантном белке с помощью 15-звенного пептидного линкера аминокислот соединяли вариабельный домен тяжелой цепи этого иммуноглобулина с вариабельным доменом его легкой цепи, а С-конец легкой цепи – с N-концом укороченного псевдомонадного токсина (см. рис. II.22,г). Такие молекулы гибридного токсина также оказались высокоспецифичными цитотоксическими агентами по отношению к лейкозным клеткам человека, экспрессирующим на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2.

Разработанный подход продемонстрировал возможность использования специфических антител в качестве адресных частей гибридных токсинов. Это дает в руки исследователей универсальный способ адресной доставки токсинов, который в будущем позволит оказывать цитотоксическое действие на любые группы клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены, т.е. значительно расширить количество мишеней для химиотерапевтических воздействий с использованием рекомбинантных белков.

Помимо псевдомонадного экзотоксина A в качестве действующего начала в гибридных токсинах успешно применяли дифтерийный токсин, фактор некроза опухолей и A-цепь рицина. Поскольку A-белок избирательно взаимодействует с константными (Fс) частями иммуноглобулинов класса G многих млекопитающих, такой гибридный токсин в паре с иммуноглобулином, полученным против какого-либо антигена на поверхности клеток, избирательно связывается с этими клетками и убивает их. Такие иммунотоксины являются еще одним потенциальным противоопухолевым агентом и могут быть