Экспрессия генов Патрушев

641

содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонуклеотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на определенных этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже для всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно легко исследовать функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами.

Внесение множественных мутаций в разные участки полипептидных цепей исследуемых белков позволяет при наличии соответствующих эффективных методов отбора получать белки с требуемыми свойствами и уже после этого определять, какие именно аминокислоты придают такие свойства белку. Альтернативным методом исследования функциональной значимости отдельных аминокислот в белках является их целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту, например аланин. Такая последовательная замена аминокислот в полипептидных цепях изучаемых белков на остатки аланина получила название сканирование аланином. Введение аланина в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации, как это имеет место, например в случае замен на глицин или пролин, и не сопровождается ярко выраженными электростатическими или стерическими эффектами. Кроме того, аланин часто встречается в полипептидных цепях и с одинаковой частотой представлен как на внутренних, так и на внешних участках полипептидных цепей белковых глобул. С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты, образующие активный центр ферментов, исследовать участки полипептидных цепей, существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами, изучать

642

структуру эпитопов полипептидных цепей, а также ряд других структурных и функциональных особенностей белков.

Еще одним универсальным методом замены определенных аминокислот

вполипептидных цепях белков in vivo является использование аминоацилированных различными аминокислотами супрессорных тРНК, которые узнают нонсенс-триплеты в мутантных мРНК в процессе трансляции. В результате в соответствующее место полипептидной цепи взамен аминокислоты, присутствующей в белке дикого типа, встраивается аминокислота, которую несет аминоацилированная супрессорная тРНК. В настоящее время в дополнение к природным супрессорным тРНК E. coli синтезированы in vitro гены, кодирующие супрессорные РНК новой специфичности. В итоге до 13 аминокислотных замен может быть произведено

всинтезирующейся in vivo полипептидной цепи в результате супрессии кодона UAG (amber). С использованием такого подхода, в частности, удалось произвести >1600 замен аминокислот Lac-репрессора E. coli и локализовать участки полипептидной цепи, существенные для связывания индуктора, прочного связывания оператора и термостабильности белка.

Важным преимуществом метода амбер-супрессии перед другими методами направленного мутагенеза у бактерий и бактериофагов является то, что он не требует синтеза большого числа мутантных генов и их последующего отбора, так как введение одного мутантного гена в составе экспрессирующего вектора в клетки разных супрессорных штаммов E. coli позволяет получать разные замены аминокислот с одновременной сверхпродукцией мутантного белка в бактериальных клетках. Это облегчает его последующую очистку и изучение биохимических свойств.

8.1.4.Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе

Разработка метода полимеразной цепной реакции принципиально изменила ситуацию в исследованиях по направленному мутагенезу. Использование ПЦР для направленного мутагенеза основано на применении в качестве праймеров олигонуклеотидов, не полностью комплементарных матричной ДНК. Повышенные требования к комплементарности накладываются лишь на последний, 3’-концевой, нуклеотид праймера, но даже в случае 3’- концевой некомплементарности праймеры часто продолжают функционировать

643

в системе ПЦР, хотя и с разной эффективностью. В то же время некоторая способность 17-нуклеотидного праймера инициировать ПЦР проявляется даже при наличии всего восьми нуклеотидов, комплементарных матрице, три из которых расположены на его 3’-конце. Таким образом, простейшим способом введения сайт-специфических мутаций в амплифицируемый фрагмент ДНК является использование праймеров, частично комплементарных матрице, т.е. содержащих необходимые мутантные нуклеотиды. Этот способ применяется для создания в амплифицируемом продукте новых сайтов рестрикции для последующего его клонирования. Такой подход удобен для встраивания амплифицируемого продукта в экспрессирующий вектор в одной открытой рамке считывания (ОРС) с инициирующим ATG-кодоном вектора. Действительно, как уже обсуждалось в главе 7, экспрессирующие векторы часто содержат 5’-концевую часть будущего рекомбинантного гена, включая регуляторные последовательности, промотор, ATG-кодон и иногда дополнительные кодоны нескольких последующих аминокислот. При конструировании таких векторов в последовательности, следующие за ATGкодоном, вводят сайты рестрикции, по которым и встраивают фрагмент экспрессируемого гена, кодоны которого (для полноценной экспрессии гена) должны находиться в одной ОРС с ATG-кодоном вектора. Положение природных сайтов рестрикции в клонируемом гене редко отвечает требованиям ОРС вектора. Поэтому введение искусственных сайтов рестрикции в клонируемый фрагмент с помощью праймеров, не полностью комплементарных матрице, является хорошим решением проблемы.

Вырожденные праймеры, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точковые мутации, также используют для сканирования мутациями определенных участков ДНК. В таком классическом варианте постановки ПЦР кроме точковых мутаций можно легко получать делеции и вставки. Дальнейшим усовершенствованием метода направленного мутагенеза с помощью ПЦР явилась разработка подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров (рис. II.18). Этот метод позволяет не только целенаправленно получать точковые мутации, делеции и вставки, но и гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы.

Для получения точковых мутаций используют пару праймеров, в которых

644

изменен соответствующий нуклеотид или небольшая группа нуклеотидов (мутантный сайт обозначен на рис. II.18,1 прямоугольниками внутри праймеров). При этом внутренние праймеры b и с комплементарны друг другу.

Рис. II.18. Использование ПЦР для получения мутаций

Получение точковых мутаций (1), делеций (2) и вставок (3): a и d – внешние праймеры, b и c – внутренние праймеры. AB и CD – фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате ПЦР с использованием праймеров a и b, а также c и d соответственно. После гибридизации друг с другом объединяемых фрагментов ДНК сформировавшимися комплементарными последовательностями нуклеотидов одноцепочечные участки достраиваются ДНК-полимеразой в процессе ПЦР

645

В первых ПЦР в отдельных пробирках амплифицируют правую и левую части мутагенизируемого сегмента ДНК с использованием пар праймеров a + b и с + d, что приводит к образованию двух фрагментов ДНК, перекрывающихся на участках, которые содержат включенные праймеры (этапы 1 и 2). Фрагменты очищают от праймеров, смешивают друг с другом в эквимолярном соотношении и после цикла тепловой денатурации и ренатурации используют в качестве матрицы в другой ПЦР с внешними праймерами a и d (этап 3). На этом этапе в первом цикле ПЦР происходит достройка цепей перекрывающихся фрагментов ДНК (пунктирные линии на рис. II.12,1), и образовавшийся фрагмент двухцепочечной ДНК, содержащий требуемую мутацию, далее служит матрицей для амплификации и по завершении ПЦР присутствует в реакционной смеси в препаративном количестве.

Тот же принцип объединения двух фрагментов ДНК, перекрывающихся за счет праймеров, используется при получении делеций и вставок. Для создания делеции (на рис. II.18,2 обозначена прямоугольниками на цепях ДНК) берут внутренние праймеры b и с, 5’-концы которых комплементарны матрице по одну сторону делетируемой последовательности нуклеотидов, а 3’-концы – последовательности нуклеотидов, фланкирующей другой ее конец. Образующиеся при этом продукты ПЦР AB и СD перекрываются в точке делеции и далее используются, как и в предыдущем случае. При получении вставок (см. рис. II.18,3) применяют внутренние праймеры b и с, комплементарные друг другу своими 5’-концевыми частями, которые соответствуют образуемой олигонуклеотидной вставке во фрагмент матричной ДНК. 3’-Концы этих праймеров комплементарны участкам ДНК-матрицы, непосредственно примыкающим к сайту, в который производится вставка олигонуклеотида.

С помощью метода ПЦР удается легко получать и множественные мутации в конкретных участках ДНК. В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, причем один из них вводят в

реакционную смесь в высокой концентрации. Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида, что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен

646

нуклеотидов. В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК-полимеразы.

8.2. Белковая инженерия

После рассмотрения способов получения сайт-специфических мутаций необходимо сделать лишь один шаг, чтобы оказаться лицом к лицу с бурно развивающимся направлением молекулярной генетики, называемым белковой инженерией. Действительно, разработка методов направленного мутагенеза дала возможность не только с высокой точностью модифицировать отдельные белки и изучать их структурно-функциональные взаимоотношения, но и конструировать новые белки, не существовавшие в природе. Впечатляющими результатами применения такого подхода являются гибридные белки, получаемые путем объединения фрагментов и функциональных доменов разных полипептидных цепей с использованием генно-инженерных методов.

Другое перспективное направление белковой инженерии – это конструирование биологически активных пептидов, обладающих фармакологической активностью.

8.2.1.Библиотеки пептидов и эпитопов

Вживом организме большинство биологических процессов управляется посредством специфических белок-белковых или белково-нуклеиновых взаимодействий. К таким процессам относятся, например регуляция транскрипции генов под действием различных белковых факторов, взаимодействие белковых лигандов с рецепторами на поверхности клеток, а также специфическое связывание антигенов соответствующими антителами. Понимание молекулярных механизмов взаимодействия белковых лигандов с рецепторами имеет большое фундаментальное и прикладное значение. В частности, разработка новых лекарственных препаратов белковой природы обычно начинается с идентификации исходной последовательности аминокислот, обладающей требуемой биологической активностью (так называемая "основная" (lead) последовательность). Однако пептиды с основной последовательностью аминокислот могут обладать и нежелательными биологическими свойствами: низкой активностью,

647

токсичностью, малой стабильностью в организме и т.п.

До появления библиотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию библиотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления среди них пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие библиотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например антителам.

По способам получения библиотеки пептидов разделяются на три группы. К первой группе можно отнести библиотеки, полученные с использованием химического синтеза пептидов, в которых индивидуальные пептиды иммобилизованы на микроносителях. При таком подходе после присоединения очередных аминокислот в индивидуальных реакционных смесях к пептидам, иммобилизованным на микроносителях, содержимое всех реакционных смесей объединяют и разделяют на новые порции, которые используют на следующей стадии присоединения новых аминокислотных остатков. После проведения ряда таких этапов оказываются синтезированными пептиды, содержащие последовательности использованных в синтезе аминокислот во всевозможных случайных сочетаниях.

Библиотеки пептидов, иммобилизованных на микроносителях, обладают существенным недостатком: они требуют при скрининге использования очищенных рецепторов, находящихся в растворимой форме. В то же время в большинстве случаев при биологических испытаниях, проводящихся для фундаментальных и фармакологических исследований, чаще всего находят применение рецепторы, ассоциированные с мембранами. По второму способу

648

библиотеки пептидов получают с помощью твердофазного синтеза пептидов, при котором на каждой стадии химического присоединения очередной аминокислоты к растущим пептидным цепям используют эквимолярные смеси всех или некоторых аминокислот-предшественников. На конечной стадии синтеза проводят отделение пептидов от носителя, т.е. перевод их в растворимую форму. Третий подход к конструированию библиотек пептидов, к описанию которого мы сейчас переходим, стал реальным именно благодаря развитию методов генной инженерии. Он прекрасно иллюстрирует возможности таких методов и, несомненно, является крупным достижением в их применении. В этой связи рассмотрим более подробно результаты использования библиотек пептидов в исследовании эпитопов (антигенных детерминант) белков.

Генно-инженерная технология получения гибридных белков позволила разработать эффективный метод наработки коротких пептидов для анализа их биологической активности. Как и в случае клонотек генов, библиотеки пептидов, полученные генно-инженерными методами, представляют собой большой (часто исчерпывающий) набор коротких пептидов. Два недавно сделанных наблюдения позволяют рассматривать библиотеку пептидов одновременно и в качестве библиотеки эпитопов белков. Во-первых, короткие пептиды могут включать все основные остатки аминокислот, играющие главную роль во взаимодействии с антителами, и они в состоянии имитировать крупные антигенные детерминанты белков. Во-вторых, в большинстве случаев нековалентные связи, образуемые между немногими наиболее важными остатками аминокислот белковых лигандов и их рецепторами, вносят основной вклад в общую энергию взаимодействия лиганд–рецептор. С учетом этого любой пептид можно рассматривать как потенциальный лиганд, гаптен или часть антигенной детерминанты более крупных полипептидов, а любую библиотеку пептидов – как библиотеку эпитопов белков или потенциальных лигандов для соответствующих белковых рецепторов.

649

Рис. II.19. Схема экспрессии пептидных эпитопов на поверхности оболочки нитевидных колифагов

Пептидные эпитопы находятся в составе гибридных полипептидных цепей минорного белка pIII (а) или основного белка pVIII вирусной оболочки (б). Стрелки указывают положение кодирующих эпитопы олигонуклеотидных фрагментов в геноме бактериофага, а также положение самих эпитопов. В составе полипептида pIII (а) показана только одна копия эпитопа (на самом деле их число достигает 4–5)

Библиотека пептидов, полученная в результате реализации третьего подхода, в современном виде представляет собой набор десятков или даже сотен миллионов коротких различающихся последовательностей аминокислот, которые экспрессированы на поверхности вирионов бактериофагов в составе их собственных структурных белков. Это становится возможным благодаря введению методами генной инженерии в геном бактериофагов гибридных рекомбинантных генов, кодирующих измененные структурные белки его вирионов. (Данный метод известен под названием фагового дисплея.) В результате экспрессии таких генов образуются гибридные белки, на N- или С- концах которых (см. ниже) присутствуют дополнительные последовательности аминокислот. В наиболее хорошо разработанной системе, позволяющей конструировать библиотеки пептидов генно-инженерными методами,

650

используют небольшой нитевидный колифаг f1 и два его белка: основной и минорный белки оболочки pVIII и pIII. In vivo оба белка синтезируются в виде полипептидных цепей с короткими N-концевыми сигнальными последовательностями, которые отщепляются сигнальной пептидазой во время их созревания после переноса к внутренней части бактериальной мембраны. Зрелые белки встраиваются в оболочку бактериофага в процессе ее сборки. При этом белок pVIII образует основную оболочку бактериофага, тогда как четыре или пять молекул pIII ассоциированы с концевой частью вириона и обеспечивают взаимодействие вирусных частиц с половыми ворсинками клеток E. coli (рис. II.19). Генно-инженерными методами пептиды соединяют с белками

– непосредственно с их N-концевыми последовательностями или на небольшом от них расстоянии. Концевые последовательности большинства белков являются более гибкими и, как правило, экспонируются на поверхности глобулы, что позволяет получать гибридные рекомбинантные белки без существенного нарушения их основных свойств, а также делает интегрируемые пептиды доступными для распознавания извне. Кроме того, в таком положении и пространственная структура самих пептидов испытывает меньшее влияние белка-носителя. В ходе экспериментов было установлено, что введение чужеродных пептидов в N-концевую часть белка pIII не оказывает существенного влияния на жизнеспособность и инфекционность фаговых частиц, тогда как соединение пептидов длиной >5 аминокислотных остатков с N-концевой частью белка pVIII нарушает сборку вирионов. Последнее затруднение можно преодолеть доставкой к месту сборки вирионов молекул белка pVIII дикого типа, синтез которых направляется соответствующим геном вируса-помощника. В этом случае оболочка бактериофага будет содержать как измененные белки pVIII, так и полипептиды дикого типа от вируса-помощника.