Экспрессия генов Патрушев

581

резкому снижению уровня транскрипции клонированного гена, низкому внутриклеточному содержанию соответствующей мРНК и белкового продукта ее трансляции.

Существенным различием двух систем регулируемой экспрессии является способ их индукции. В случае регуляторной системы lac-оперона чаще всего используют синтетический аналог природного индуктора (алло-лактозы) – изопропил–β-D-тиогалактопиранозид (IPTG). Индуктор связывается с молекулой репрессора и нарушает его взаимодействие с операторным участком ДНК. Область lac-промотора становится доступной для РНКполимеразы, которая с высокой эффективностью начинает транскрибировать гены, расположенные вслед за промотором. В отличие от этого в системе репрессии-дерепрессии фага λ используют ген репрессора cI, содержащий температурочувствительную мутацию. Наличие такой мутации приводит к тому, что мутантный белок-репрессор сохраняет свою нативную конформацию, а следовательно, и способность подавлять синтез РНК только при пермиссивной температуре (как правило, 28–30о). При повышении температуры окружающей среды до 42о происходят инактивация белка-репрессора и дерепрессия генов, расположенных под контролем промоторов PL или PR фага λ.

Использование системы репрессии–дерепрессии, чувствительной к температуре, более технологично по сравнению с химической индукцией по двум обстоятельствам: во-первых, это менее дорогой способ индукции; вовторых, для системы фага λ характерна более высокая степень репрессии генов, находящихся под ее контролем, и соответственно более низкий базальный уровень их экспрессии. Такой фактор становится решающим при клонировании и получении экспрессии генов, белковые продукты которых токсичны для клетки-хозяина. Однако несмотря на технологичность системы репрессии–дерепрессии, чувствительной к температуре, сверхпродукция рекомбинантных белков, особенно эукариотических, часто сопровождается внутриклеточным образованием их нерастворимых агрегатов, что в ряде случаев полностью отсутствует при использовании для выращивания рекомбинантных клеток температур ниже 30о (подробнее см. ниже). Эти эффекты накладывают ограничения на использование векторов с температурочувствительным контролем экспрессии для продукции

582

эукариотических и в меньшей степени прокариотических белков в бактериальных клетках.

Для обеспечения регулируемой тканеспецифической экспрессии рекомбинантных генов в соматических клетках животных и растений в составе векторов используют энхансеры, которые избирательно стимулируют транскрипцию в соответствующих тканях и не оказывают такого действия на гены в тканях, клетки которых не экспрессируют необходимые регуляторные белки. Кроме того, популярным становится введение в экспрессирующие эукариотические векторы пограничных последовательностей нуклеотидов, фланкирующих клонируемые гены, которые помогают обеспечивать экспрессию рекомбинантных генов, сводя к минимуму эффект их положения в хромосомах соматических клеток. О механизмах этих явлений подробно говорилось в первой части книги.

В настоящее время, по-видимому, не существует систем репрессии клонируемых генов, которые бы полностью блокировали их транскрипцию. Это создает определенные проблемы при клонировании генов белков, токсичных для клеток-хозяев, таких как колицины, эндо- и экзонуклеазы, протеиназы и т.п.

Наряду с промоторами векторы, экспрессирующие рекомбинантные гены в клетках E. coli, должны содержать и гомологичные терминаторы транскрипции. Необходимость в этом вызвана тем, что даже нетранслируемые избыточные 3’-концевые последовательности нуклеотидов мРНК, транскрибированной с рекомбинантного гена, отрицательно сказываются на эффективности ее трансляции, что, по-видимому, связано с участием таких последовательностей в образовании сложной третичной структуры рекомбинантных мРНК.

Факторы, влияющие на эффективность экспрессии рекомбинантных генов: трансляция. Как следует из изложенного выше,

эффективность экспрессии клонированных генов в бактериальных и эукариотических клетках во многом зависит от эффективности их транскрипции, т.е. от уровня внутриклеточного содержания соответствующих мРНК. Однако эффективность экспрессии рекомбинантных генов не в меньшей степени зависит и от эффективности трансляции таких мРНК рибосомами. При работе с рекомбинантными ДНК чаще всего приходится иметь дело с гетерологичными системами, в которых клонированные экспрессируемые ДНК чужеродны по

583

отношению к генетическому окружению и ферментативным системам бактериальных или эукариотических клеток-хозяев. В первой части книги в качестве примеров были рассмотрены некоторые факторы, играющие большую роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Такие факторы вносят свой вклад и в эффективность экспрессии рекомбинантных генов. Однако в этом случае необходимо всегда иметь в виду уровень соответствия регуляторных факторов клеток-хозяев регуляторным последовательностям мРНК, которые являются транскриптами рекомбинантных генов. В частности, на эффективность трансляции чужеродных мРНК в бактериальных клетках оказывает сильное влияние первичная структура небольшого участка 5’-концевой части мРНК перед инициирующим AUGкодоном, частично комплементарная 3’-концевой части 16S рРНК. Этот участок мРНК называют последовательностью Шайна–Дальгарно, или SDпоследовательностью.

SD-последовательность мРНК служит сигналом для взаимодействия рибосом с мРНК и обеспечивает инициацию трансляции с правильного AUGкодона. Она представляет собой короткую последовательность нуклеотидов, обогащенную пуриновыми основаниями, и расположена за 4–9 нуклеотидов перед AUG-кодоном:

(в приведенном примере прописными буквами у lacZ-мРНК изображена SDпоследовательность нуклеотидов, комплементарная соответствующей пиримидиновой последовательности 16S рРНК, и подчеркнут инициирующий кодон). Различия в эффективности распознавания такого сайта на мРНК рибосомами приводят к различиям в эффективности экспрессии соответствующих генов. Достаточно наличия в SD-сайте трех нуклеотидов, комплементарных соответствующему участку 16S РНК, чтобы рибосомы приобретали способность связывать эту мРНК. Помимо SDпоследовательности в мРНК, по-видимому, имеются и другие участки, необходимые для эффективной инициации трансляции рибосомами, так как на основании только первичной структуры мРНК в настоящее время невозможно

584

предсказать эффективность сайта связывания рибосом. Более того, сайты инициации трансляции на мРНК, обладающие протяженной гомологией с 16S рРНК, являются малоэффективными, возможно, из-за слишком прочного связывания рибосом с мРНК.

Существенным фактором, оказывающим влияние на эффективность трансляции мРНК рибосомами, может быть вторичная структура мРНК в окрестностях инициирующего кодона. Из всего вышеизложенного следует, что некодирующая 5’-концевая часть мРНК играет важную роль в эффективности ее трансляции рибосомами, и, по крайней мере, эти особенности их трансляции необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии рекомбинантных генов в клетках E. coli. Современные экспрессирующие векторы построены таким образом, что промотор, с которого начинается транскрипция клонированного гена, а также следующая за ним последовательность нуклеотидов, включающая инициирующий ATG-кодон, являются частью генов, эффективно экспрессирующихся в клетках E. coli. Сразу вслед за ATG-кодоном вектора располагают уникальные сайты рестрикции, по которым проводят встраивание кодирующей части клонируемого гена, экспрессию которого хотят получить. В том случае, если сайт рестрикции, по которому производится клонирование, расположен в начале кодирующей части природного гена, в результате транскрипции такой рекомбинантной молекулы образуется химерная мРНК. 5’-Концевая часть этой мРНК от промотора до сайта рестрикции для клонирования соответствует последовательности нуклеотидов вектора и кодирует несколько аминокислот природного гена, регуляторные последовательности которого использовали для конструирования экспрессирующего вектора. Протяженная же 3’-концевая часть такой мРНК будет соответствовать клонированной последовательности нуклеотидов. Если соединение этих двух частей мРНК произошло в одной рамке считывания, то в результате ее трансляции будет образовываться химерный полипептид, N-концевая часть которого кодируется вектором, а С- концевая – клонированным фрагментом ДНК. Примерами таких экспрессирующих векторов могут быть плазмиды pUC18 и pUC19 (см. рис. II.5,б), продукты экспрессии которых представляют собой химерные белки, а N-концевая часть содержит N-концевые аминокислотные остатки β- галактозидазы E. coli.

585

Превосходным вектором, прекрасно зарекомендовавшим себя в работе, является экспрессирующий вектор pPR-TGATG-1, сконструированный в лаборатории С.В. Машко (г. Москва). Вектор функционирует по тому же самому принципу. В нем структурная часть экспрессируемого гена соединяется через уникальный сайт рестрикции SacI с инициирующим кодоном ATG (см. рис. II.11,б). В результате образуется гибридный оперон, транскрибируемый с промотора λ-PR, дистальный цистрон которого представлен клонируемым геном, а цистрон, проксимальный промотору PR, содержит гибридный ген cro’-

состоящий из слитых частей генов cro фага λ, хлорамфениколацетилтрансферазы cat и trpE E. coli. 3’-Концевая часть цистрона содержит область реинициации трансляции, SD-последовательность гена trpD E. coli и перекрывающиеся кодоны терминации и инициации трансляции (TGATG). В этой последовательности 3’-концевой нуклеотид G является первым нуклеотидом уникального сайта рестрикции SacI (GAGCTC). В процессе синтеза белка, направляемого вектором, образуется короткий гибридный пептид Cro’-Cat’-TrpE длиной ~120 аминокислот. Сразу же после терминации его синтеза с высокой эффективностью происходит реинициация синтеза полипептида, кодируемого клонированным геном, на перекрывающемся с кодоном TGA ATG-кодоне. Поскольку промотор PR в этом векторе контролируется температурочувствительным репрессором фага λ cIts857, экспрессия клонированного гена индуцируется повышением температуры окружающей среды до 42о и сопровождается инактивацией репрессора.

Приведенные примеры четко демонстрируют роль двух основных факторов, оказывающих влияние на эффективность экспрессии чужеродных клонированных генов, находящихся в составе экспрессирующих векторов в бактериальных клетках. Этими факторами являются, во-первых, оптимальная транскрипция клонированных генов и, во-вторых, эффективная трансляция транскрибированной мРНК. В обоих случаях наилучшие результаты могут быть получены при объединении в составе вектора структурной части клонированного чужеродного гена с генетическими элементами, регулирующими транскрипцию и трансляцию (промоторы, SDпоследовательности и т.п.) бактериальных клеток-хозяев или их вирусов.

586

Знание главных принципов, лежащих в основе регуляции транскрипции и трансляции, позволяет конструировать новые регуляторные последовательности (например промотор Taq) путем объединения известных регуляторных элементов или использования искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов, представляющих собой усредненные канонические регуляторные последовательности, учитывающие особенности большого числа природных регуляторных элементов. Однако этими важными факторами не исчерпывается возможность оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в чужеродном генетическом окружении.

Среди других факторов, оказывающих влияние на эффективность трансляции, следует упомянуть частоту встречаемости кодонов при кодировании белков в структурных частях разных генов. В настоящее время установлено, что использование синонимических кодонов (кодирующих одну и ту же аминокислоту) вырожденного генетического кода не случайно и отражает количественную представленность отдельных изоакцепторных тРНК в клетках организма. С другой стороны, частота использования кодонов в разных генах одного и того же организма является эффективным фактором, регулирующим уровень экспрессии этих генов в процессе трансляции. Чем реже тот или иной кодон используется для кодирования аминокислоты в данном организме, тем с меньшей скоростью он будет транслироваться рибосомами вследствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такой кодон. Так, в группе белков дрожжей с высоким уровнем экспрессии 96% аминокислот кодируются только 25 из 61 возможного кодона. Замена этих 25 предпочтительных кодонов в 5’-концевых частях генов белков с высоким уровнем экспрессии на редко встречающиеся кодоны снижает уровень синтеза как белков, так и их мРНК.

Кроме того, на эффективность трансляции кодона оказывает влияние и контекст кодона, т.е. соседние, окружающие кодон последовательности нуклеотидов. Этот феномен предпочтительного использования одних кодонов перед другими необходимо учитывать в опытах по оптимизации экспрессии чужеродного генетического материала в гетерологичном генетическом окружении, поскольку несоответствие в частотах использования кодонов у организмов разных видов может служить серьезным препятствием для получения эффективной экспрессии клонируемых генов. Снижение уровня экспрессии под влиянием подобных факторов, в частности, наблюдали при

587

попытках экспрессии генов растений в клетках дрожжей, а также в других гетерологичных системах. Таким образом, эффекты, возникающие в связи с различной частотой использования кодонов, необходимо учитывать при подборе генетических систем для эффективной экспрессии клонированных чужеродных генов. Этот фактор может оказаться одним из решающих при получении полностью синтетических генов, например генов пептидных гормонов, для использования их в биотехнологии, а также при планировании мутационных замен нуклеотидов в белковой инженерии.

Факторы, влияющие на эффективность экспрессии рекомбинантных генов: стабильность рекомбинантных белков и РНК.

Важным фактором, определяющим уровень экспрессии рекомбинантных генов в реципиентных клетках, является стабильность кодируемых этими генами мРНК и белков. В первой части книги подробно рассматривалось значение таких факторов в регуляции экспрессии генов. Не менее важную роль эти феномены играют и в контроле уровня экспрессии рекомбинантных генов в искусственных генетических системах.

Как было упомянуто выше, замены кодонов в мРНК дрожжей на синонимические приводят не только к снижению уровня трансляции измененных мРНК в клетках дрожжей, но и сопровождаются уменьшением стабильности самих мРНК. Требование достаточного уровня стабильности мРНК является одним из факторов, определяющих давление отбора на использование конкретных синонимических кодонов для кодирования белков. Важную роль во внутриклеточной стабильности мРНК играют элементы ее вторичной структуры. Так, образование шпилек на 3’-конце мРНК препятствует ее деградации под действием бактериальных экзонуклеаз, РНКазы II и полинуклеотидфосфорилазы. Поскольку изменение первичной структуры с учетом возможной вторичной структуры без изменения функциональных свойств представляется в настоящее время сложной задачей, проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных РНК решается главным образом путем введения мутаций в гены экзо- и эндонуклеаз бактериальной клетки-хозяина. Так называемые безРНКазные штаммы E. coli находят применение в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид в генной инженерии. При этом решается двойная задача: с одной стороны, в таких клетках повышается стабильность транскриптов рекомбинантных генов, а с

588

другой – пониженный внутриклеточный уровень определенных РНКаз способствует более эффективной очистке рекомбинантных белков, так как для многих препаратов ферментов даже незначительные примеси нуклеазной активности бывают нежелательны.

Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках E. coli,

– включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геномом, кодирующим белок (например геном β-галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также A- и B-цепей инсулина.

Для разделения рекомбинантного пептида и белка-носителя можно использовать и протеолитические ферменты. Для этого требуемый пептид соединяют с белком-носителем с помощью последовательности аминокислот, специфически расщепляемой протеолитическим ферментом, например пептидазой клостридий (клострипаином) в случае получения кальцитонина или трипсином для получения β-эндорфина. Второй подход, позволяющий защищать рекомбинантные белки от внутриклеточного протеолиза, – выведение их в периплазматическое пространство или окружающую среду после завершения биосинтеза. При таком подходе рекомбинантные полипептиды соединяют с сигнальными последовательностями аминокислот белков (β-лактамаза, OmpA, OmpF, PhoA), секретируемых во внешнюю среду и

589

периплазматическое пространство. Подобным путем были получены, например проинсулин, гормон роста человека и β-эндорфин.

Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках: тельца включения. Экспрессия эукариотических генов в бактериальных клетках связана еще с одной проблемой: большая часть рекомбинантных эукариотических белков, а также некоторые прокариотические белки при очень высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя в клетках так называемые тельца включения. Тельца включения представляют собой частицы, состоящие главным образом из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся, как правило, в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинхлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует ренатурации, в процессе обработки денатурирующими агентами белки могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок.

В чем же причина такого аномального поведения рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках? Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных механизма: компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации. Образующиеся в результате трансляции мРНК рибосомами в эндоплазматическом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. При этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, pH в которых составляет 4,5–5,5. В то же время pH цитоплазмы бактериальных клеток приближается к 7,8, в этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Ca2+.

590

Посттрансляционные модификации белков, в частности фосфорилирование, гидроксилирование, гликозилирование и ограниченный протеолиз, происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток, также оказывают большое влияние на растворимость белков, их стабильность и биологические функции. Это особенно относится к секретируемым белкам эукариот. Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения на использование бактерий в биотехнологии.

Наконец, третьим ключевым фактором, оказывающим влияние на растворимость белков, является их нативная конформация в растворе. Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных цепей некоторых белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми шаперонами, которые необходимы для эффективного формирования третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в состав конечной белковой структуры. Шапероны оказывают влияние лишь на конформацию полипептидных цепей и не действуют на ковалентные связи белковых молекул. К этому классу полипептидов относятся цитозольные белки теплового шока Hsp70 и Hsp60, а также гомологичные им белки, например белок, связывающийся с тяжелой цепью иммуноглобулинов (BiP). Шапероном является также ядерный нуклеоплазмин, обеспечивающий сборку нуклеосом. У E. coli соответствующие функции выполняют белки SecB, триггерный фактор, а также GroEL и GroES, обеспечивающие экспорт полипептидов из цитоплазмы и участвующие в морфогенезе бактериофагов. Два последних белка – GroEL и GroES, известные также как Cpn60 и Cpn10, кодируются генами оперона groE, регулируемого тепловым шоком. Белки, эволюционно родственные белку GroEL, получили название шаперонинов. Один из таких белков, обнаруженный в хлоропластах высших растений, участвует в сборке D-рибулозо-1,5- дифосфаткарбоксилазы-оксигеназы (Rubisco), которую часто используют в качестве модельного белка в исследованиях механизмов сворачивания полипептидных цепей.

Из других белков, участвующих в сворачивании полипептидных цепей, следует упомянуть так называемые фолдазы и изомеразы. Наиболее хорошо