Экспрессия генов Патрушев

341

специфические транс-действующие факторы. Возможно, обнаруженные РНПчастицы, локализующие РНК, содержат в своем составе такие факторы, а также ряд других белков, обеспечивающих взаимодействие РНК с системами ее цитоплазматического транспорта и фиксации в местах постоянной локализации. Большую роль в этих процессах отводят и комплементарным РНК-РНК-взаимодействиям.

Функции локализованных РНК. Направленная доставка и накопление РНК в определенных частях эукариотических клеток являются мощным механизмом, регулирующим экспрессию соответствующих генов в онтогенетическом развитии организмов. Прежде всего, локализованные РНК обеспечивают высокий уровень синтеза кодируемых ими белков в определенных частях клеток. Одновременно с этим предотвращается трансляция этих мРНК в других внутриклеточных компартментах как путем их избирательной деградации, так и с участием белковых репрессоров трансляции. Локализуемые изоформы мРНК с разной специфичностью внутриклеточной доставки, которые могут образовываться в результате альтернативного сплайсинга, обеспечивают синтез соответствующих изоформ белков в разных клетках или цитоплазматических доменах одной и той же клетки. При этом асимметричное внутриклеточное распределение мРНК, в свою очередь, может приводить к неравномерному их распределению в дочерних клетках, получающих специфические наборы мРНК. Это может быть одним из ключевых моментов последующей дифференцировки клетокпотомков. Ряд РНК, локализующихся в цитоплазматических компартментах, не кодируют белки. Во многих случаях их роль не ясна. Полагают, что они могут выполнять структурные функции в локализующих РНП-частицах или органеллах, например зародышевых гранулах ооцитов. Кроме того эти РНК могут участвовать в фиксации локализуемых РНК в местах их накопления в цитоплазме.

От молекул ооцита дрозофилы к зародышу. Не все мРНК ооцита имеют своим источником питающие клетки. В частности, ген gurken, играющий ключевую роль в становлении переднезадней и дорсовентральной осей ооцита, транскрибируется в его ядре. Для этой РНК характерна строго выраженная внутриклеточная локализация. На стадии 7 она ассоциирована только с задним полюсом ооцита, на стадии 8 – с обоими полюсами, а на стадиях 8–10 – с

342

переднеспинной зоной. Белок Gurken является секретируемым TGFα-подобным фактором роста, который передает ключевой сигнал к окружающим ооцит фолликулярным клеткам, которые обеспечивают становление осей ооцита. Сначала сигнал в виде секретируемого фактора поступает к фолликулярным клеткам, окружающим заднюю часть ооцита, что обеспечивается соответствующей локализацией мРНК gurken. Это приводит к становлению переднезадней оси ооцита и поляризации его цитоскелета, построенного из микротрубочек, что является важнейшим условием дальнейшей локализации РНК. Сигнал в виде вышеупомянутого фактора роста, поступающий из переднеспинной части ооцита к питающим клеткам, приводит к становлению дорсовентральной оси яйцевой камеры. Локализация мРНК gurken в переднеспинной части ооцита, в свою очередь, является следствием зависимого от цитоскелета перемещения ядра ооцита в эту зону цитоплазмы.

мРНК bicoid начинает транслироваться в месте ее локализации на переднем полюсе раннего зародыша вскоре после оплодотворения. Поскольку на этой стадии зародыш представляет собой бесклеточный синцитий с многими ядрами, образующийся белок диффундирует к заднему полюсу зародыша, образуя градиент концентрации вдоль его переднезадней оси, которая максимальна в его передней части. Белок Bicoid является гомеодоменным фактором транскрипции. Он активирует синтез РНК соответствующих генов только в ядрах, расположенных в передней половине зародыша. При этом активация генов зависит от концентрации фактора. Например, ген hunchback содержит высоко аффинный сайт связывания белка Bicoid и активируется как в местах высокой, так и низкой концентраций фактора. В отличие от этого, такие гены как orthodenticle и empty spiracles обладают низкоаффинными сайтами связывания фактора и начинают транскрибироваться лишь в ядрах, расположенных ближе к переднему концу зародыша. По такому механизму формируются островки дифференцирующихся клеток передней части зародыша с разными группами экспрессирующихся генов. Однако это не все. Белок Bicoid обладает способностью функционировать не только как фактор транскрипции, но и как репрессор трансляции определенных РНК (например caudal), с 3'UTR которых он прямо взаимодействует. В результате передняя локализация мРНК bicoid приводит к образованию обратного градиента концентрации белка Caudal, РНК которого исходно не локализована. В итоге

343

пик концентрации этого белка имеет место в задней части зародыша, где он также определяет наборы транскрибирующихся генов.

Приведенные примеры охватывают далеко не все механизмы, детерминирующие дифференцировку клеток в развивающемся зародыше, и служат для иллюстрации ключевой роли посттранскрипционной внутриклеточной локализации мРНК в контроле экспрессии генов, транскриптами которых они являются. Как можно видеть уже из этих примеров, посттранскрипционное перемещение и метаболизм РНК являются важными элементами регуляции экспрессии генов в онтогенезе. Ниже некоторые другие аспекты метаболизма РНК как регулятора экспрессии генов будут рассмотрены более подробно.

3.3.2. Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов

Разнообразные механизмы процессинга РНК в клетках были уже рассмотрены выше. Как оказалось, созревание мРНК играет важную роль и в регуляции экспрессии тех генов, транскриптами которых эти РНК являются. Одними из первых доказательства такого рода регуляции экспрессии генов были получены для морских ежей. Транскрипты, обнаруживаемые в цитоплазме клеток на стадии бластулы, можно видеть с помощью специфических ДНК-зондов в ядрах клеток кишечника. В ядрах клеток бластулы и дифференцированных клеток кишечника морских ежей синтезируются похожие наборы РНК, однако наборы цитоплазматических РНК, участвующих в трансляции, у этих типов клеток сильно различаются вследствие разного процессинга предшественников мРНК в ядрах.

Убедительные данные о контроле экспрессии генов на уровне процессинга РНК получены в экспериментах с вирусами клеток животных. Вирусы полиомы и SV40 не способны размножаться в недифференцированных стволовых клетках тератокарциномы. Однако, если стволовые клетки дифференцируются в клетки соматических типов, они становятся пермиссивными (чувствительными) к этим вирусам. Одной из причин исходной непермиссивности стволовых клеток к указанным вирусам является их неспособность осуществлять процессинг (сплайсинг) вирусных РНК в ядрах. Это сопровождается накоплением в ядрах стволовых клеток гигантских предшественников вирусных РНК, которые в конце концов разрушаются.

344

Данные такого рода в совокупности свидетельствуют о зависимости развития соматических клеток от образования в них специфических ферментов сплайсинга, которые отвечают за процессинг предшественников клеточных мРНК, необходимых для функционирования и дифференцировки соматических клеток.

Рис. I.35. Схема формирования активаторов и репрессоров транскрипции, кодируемых геном CREM и образующихся в результате альтернативного сплайсинга

В верхней части рисунка изображена схема гена CREM, включающая альтернативные промоторы Р1 и P2, кодоны альтернативной инициации и терминации трансляции, а также экзоны, кодирующие различные домены факторов. Внизу представлены комбинации последовательностей экзонов, объединяющихся в зрелые мРНК, которые кодируют разных представителей групп репрессоров и активаторов транскрипции, а также ICER-белков

Альтернативный сплайсинг. Одним из примеров посттранскрипционных модификаций РНК, имеющих большое значение в регуляции экспрессии генов эукариот, является альтернативный сплайсинг. Сущность его заключается в том, что в результате посттранскрипционного процессинга предшественника мРНК, из которого в результате сплайсинга вырезаются некодирующие последовательности нуклеотидов, соответствующие интронам транскрибированного гена, образуются зрелые мРНК, различающиеся по своей первичной структуре. В результате в разных

345

клетках и тканях из одного и того же предшественника получаются молекулы зрелых мРНК, которые объединяют в различных комбинациях последовательности экзонов транскрибированного гена.

На рис. I.35 представлена схема экзонной структуры гена модулятора cAMP-респонсивного элемента человека (CREM), кодирующего целое семейство позитивно и негативно действующих изоформ фактора транскрипции, связывающихся с cAMP-респонсивными регуляторными элементами ДНК – CRE. Данное семейство факторов вовлечено в регуляцию экспрессии генов, участвующих в обеспечении эндокринных функций организма и сперматогенезе. Ген построен из функциональных модулей, заключающих в себе информацию двух промоторов, двух альтернативных ДНК-связывающих доменов, а также нескольких транс-действующих доменов этих факторов. ПремРНК транскрибируется с неиндуцируемого промотора P1 и подвергается альтернативному сплайсингу, специфичность которого определяется типом ткани, в которой он происходит. Например, во время сперматогенеза происходит переключение с синтеза репрессоров транскрипции CREMα, CREMβ и CREMγ на образование CREMτ, который содержит в своей полипептидной цепи две дополнительные последовательности, обогащенные Gln (Q1 и Q2), необходимые для транс-активации транскрипции. Более короткий транскрипт, синтез которого инициируется на промоторе P2, процессируется с образованием зрелых мРНК, которые кодируют группу небольших молекул репрессоров (ICER). Инициация синтеза РНК на промоторе P2 активируется под действием ритмических гормональных сигналов эпифиза мозга.

Рассмотренный пример показывает важную роль альтернативного сплайсинга в расширении кодирующего потенциала генов эукариот, поскольку в результате использования такого механизма одна и та же последовательность нуклеотидов гена может кодировать несколько разных белков.

Комбинаторика объединения последовательностей нуклеотидов премРНК в процессе альтернативного сплайсинга может быть очень сложной, поскольку в него вовлекаются интроны и экзоны, а их объединение происходит с использованием различных точек сплайсинга, локализованных в этих последовательностях. Распознавание участков ДНК, в которых находятся точки сплайсинга, участвующие в конкретном акте посттранскрипционного

347

Белок TRA стабилизирует связывание белка TRA2 с энхансером сплайсинга в tra-пре-мРНК. 1–5 – экзоны

Образующийся в результате белок TRA, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую экзоном 3 гена tra, в комплексе с другими белками TRA2 и SR-белком участвует в образовании мультипротеинового комплекса на специфической последовательности альтернативного экзона в мРНК гена dsx. Подобные регуляторные последовательности обнаружены также в мРНК позвоночных и вирусов животных и получили название энхансеров сплайсинга (они не имеют отношения к энхансерам, регулирующим транскрипцию эукариотических генов). В случае dsx-пре-мРНК образование такого энхансерного комплекса, включающего и белковые факторы, узнающие 3’-концевые сайты сплайсинга, способствует взаимодействию факторов сплайсинга с его низкоэффективным 3’-концевым сайтом, расположенным перед энхансером (и последовательностью экзона 4), а также вырезанию этого интрона. Образующийся в результате трансляции такой мРНК белок DSX блокирует экспрессию генов, обеспечивающих формирование у мух мужского фенотипа. В отсутствие TRA-белка в результате объединения экзонов 3 и 5 получается альтернативный белок DSX, который не препятствует экспрессии этих генов и подавляет дифференцировку самок.

Позитивная и негативная регуляция альтернативного сплайсинга в клетках животных. У животных описано много генов, пре-мРНК которых подвергаются альтернативному сплайсингу. Однако механизмы регуляции этого процесса не так ясны, как в только что рассмотренном примере с генами дрозофилы. Основную роль в выборе альтернативных сайтов сплайсинга у животных, по-видимому, играют общие факторы сплайсинга. В частности, установлено, что простое повышение концентрации SR-белков способствует предпочтительному выбору для сплайсинга проксимально расположенных, т.е. сближенных друг с другом, сайтов сплайсинга во многих пре-мРНК.

Механизм этого явления представлен на рис. I.37 на примере гипотетической пре-мРНК, содержащей два альтернативных одинаково эффективных 5’-концевых сайта сплайсинга. Для простоты показано связывание с РНК только U1-мяРНП и SR-белка. В условиях недостатка U1мяРНП (см. рис. I.37,а) не все 5’-концевые сайты сплайсинга заполнены

348

мультибелковыми комплексами. Поскольку наиболее эффективно в альтернативном сплайсинге используется внутренний сайт, максимально сближенный со своим 3’-концевым партнером, альтернативный 5’-концевой сайт вовлекается только в том случае, если ниже расположенный сайт не занят. Повышение концентрации U1-мяРНП приводит к тому, что оба 5’-концевых сайта сплайсинга взаимодействуют с белковыми комплексами и сплайсинг происходит преимущественно с участием его максимально сближенных сайтов (см. рис. I.37,б). В этом случае SR-белки усиливают взаимодействие между расположенными по соседству U1-мяРНП-комплексами.

Рис. I.37. Механизм действия белков SR при обеспечении выбора сплайсомой альтернативных сайтов сплайсинга

U1 − U1-мяРНП. Эффективность вырезания интронов: а – 40% проксимальных, 40% дистальных; б – 80% проксимальных, 20% дистальных

У многих генов животных и их вирусов обнаружены последовательности нуклеотидов, блокирующие сплайсинг. Некоторые из этих последовательностей способствуют формированию в пре-мРНК характерной вторичной структуры, которая маскирует сайты сплайсинга. Поскольку многие белковые факторы сплайсинга обладают ДНК-расплетающей активностью и вызывают локальное плавление спирализованных участков РНК, то дифференциальная экспрессия таких факторов оказывает влияние на выбор белками сплайсинга

349

определенных сайтов. Другие негативные регуляторные элементы альтернативного сплайсинга требуют для своего функционирования наличия транс-действующих факторов. Например, белок вируса иммунодефицита человека взаимодействует с последовательностью RRE пре-мРНК и, блокируя ее сплайсинг, обеспечивает экспорт непроцессированной пре-мРНК. Описаны экзоны, также оказывающие негативное влияние на сплайсинг. Кроме того, показано, что белки гетерогенных ядерных РНП A1, A1b, A2 и B1 выступают антагонистами SR-белков при взаимодействии последних с дистальными 5’- концевыми сайтами сплайсинга. Для индивидуальных белков этой группы (A и B) характерна субстратная специфичность, и они оказывают существенное влияние на выбор конкретных сайтов сплайсинга во время процессинга премРНК, что в ряде случаев обеспечивается наличием высокоаффинных сайтов связывания для таких белков между конкурирующими 5’-концевыми сайтами сплайсинга. Например, наличие участка сильного связывания для белка А1, входящего в состав гяРНП, между двумя 5’-концевыми сайтами сплайсинга приводит к преимущественному участию в процессинге дистального сайта сплайсинга (более удаленного от 3’-концевого сайта). Такое взаимодействие не оказывает влияния на связывание обоими 5’-концевыми сайтами сплайсинга U1-мяРНП.

Рассмотренные механизмы позитивной и негативной регуляции альтернативного сплайсинга во многом гипотетичны. Однако существование внутриклеточных механизмов, с высокой точностью регулирующих этот процесс, в настоящее время доказано. Такая специфичность может достигаться за счет контролируемых изменений внутриядерной концентрации индивидуальных SR-белков и белков гетерогенных ядерных РНП-частиц, функционирующих в сочетании с регуляторными последовательностями нуклеотидов (энхансерами сплайсинга) и с сайтами сплайсинга определенной эффективности, локализованными в самих пре-мРНК. В некоторых случаях подобная регуляция требует участия дополнительных специфических факторов.

Переключение классов иммуноглобулинов. В процессе дифференцировки B-лимфоцитов происходит смена классов иммуноглобулинов, синтезируемых этими клетками. В начале дифференцировки образуются иммуноглобулины, обладающие способностью

350

как секретироваться в окружающую среду, так и интегрироваться в плазматическую мембрану B-лимфоцитов. Поверхностные иммуноглобулины выполняют здесь роль рецепторов антигенов и принадлежат к одному из двух классов белков: IgM или IgD. Белки этих двух классов обладают одинаковыми аминокислотными последовательностями в N-концевых частях, взаимодействующих с антигенными детерминантами, и различаются по С- концам. В начале процесса дифференцировки поверхностные иммуноглобулины представлены белками только класса IgM, а после первой стимуляции антигеном появляются белки обоих классов; далее, после завершения дифференцировки B-лимфоцитов, на поверхности клеток остаются иммуноглобулины только класса IgD. Именно они продолжают синтезироваться зрелыми B-лимфоцитами.

В основе феномена переключения классов иммуноглобулинов у B- лимфоцитов лежит механизм альтернативного сплайсинга. На любой стадии дифференцировки B-лимфоцитов синтезируются транскрипты генов иммуноглобулинов, в состав которых входят экзоны вариабельных частей иммуноглобулинов, а также их константных частей, как µ, так и δ, определяющих класс иммуноглобулинов (IgM или IgD соответственно). В результате альтернативного сплайсинга с последовательностями экзонов вариабельных частей в зрелой мРНК соединяются последовательности экзонов µ или δ, что и определяет, в конечном счете, класс иммуноглобулинов, образующихся в результате трансляции этих мРНК рибосомами. С помощью альтернативного сплайсинга B-лимфоциты решают вопрос и о том, какая из форм IgM – секретируемая или интегрирующаяся в мембраны – образуется в клетках. Так же как и в случае обсуждавшихся выше классов иммуноглобулинов, секретируемая и ассоциированная с мембранами формы IgM различаются по С-концевым аминокислотным последовательностям. Последовательности, кодирующие эти С-концевые домены иммуноглобулинов, добавляются в зрелые мРНК или удаляются из их предшественников в результате альтернативного сплайсинга.

Исследования последних лет показали, что регуляция экспрессии генов с помощью альтернативного сплайсинга широко распространена в клетках высших организмов. Использование такого изящного механизма позволяет одному и тому же гену кодировать несколько полипептидов, различающихся по