Билет 10

1) Методы разделения аминокислот, полипептидов, белков

Самый распространенный и универсальный метод разделения – метод хроматографии, принцип разработан русским химиком Цветом.

Существует 4 основных типа:

1. адсобрбционная;

2. распределительная;

3. ионообменная;

4. хроматография по сродству (аффинная хроматография).

При адсорбционной хроматографии разделение компонентов смеси основано на их различной полярности, в качестве адсорбента используют активированный уголь, Al₂O₃,Si₂O₃. Адсорбент в виде суспензии помещают в колонку. Образец в небольшом количестве растворителя тоже помещается в колонку. Белки адсорбируются в определенном слое адсорбента. Для разделения белков производят элюирование, элюент – полярный растворитель, буферные растворы, которые будут по-разному действовать на разные белки.

Частным случаем такой адсорбционной хроматографии является тонкослойная хроматография.

Распределительная хроматография наиболее часто используется в биохимии. Твердая фаза адсорбент служит только основой для стационарной жидкой фазы (крахмал – твердая фаза, вода – жидкая). Образец растворяют в органическом растворителе и пропускают через колонку. Различные белки, имея различное сродство к воде и органическим растворителям, растворяются в колонке и передвигаются ко дну колонки с разной скоростью.

Ионообменная хроматография.

Здесь используют ионообменные смолы – катиониты (катионный обмен) и аниониты (анионный обмен). Полистиролсульфокислоты или их соли.

Белки, которые имеют положительный заряд, они будут способны к катионному обмену, а другие белки, которые не имеют заряда, они будут свободно проходить через эту колонку. Анионный обмен – наоборот. Солевыми насыщенными растворами проводят снятие белков с адсорбента.

Аффинная хроматографияоснована на принципе избирательного взаимодействия белка со специфическими веществами, называемымилигандами, которые закреплены на носителе. Например, смесь белков содержит амиллазу, при прохождении через крахмальную прослойку, амилаза будет адсорбироваться на крахмале, а другие белки будут проходить мимо.

В последнее время широкое применение получила гель-фильтрацияилиметод молекулярных сит. С помощью этого метода можно рассортировать белки по их размерам, по величине. Для этого смесь белков пропускают через колонку, заполненную очень мелкими пористыми гранулами высокогидратированного полимера (дексатраны – полисахариды бактерии, состоят из молекул глюкозы, полимерная цепочка которых имеет очень разветвлённое строение). (связи 1-4, 1-6). Маленькие молекулы будут проходить через поры, а большие нет, т.о. происходит разделение белков по молекулярной массе. Этот метод в настоящее время очень широко используется в фармакологии, биохимических производствах.

Электрофорез.

Определяющую роль в этом методе играют знак и величина электрического заряда на данной белковой молекуле.

БеретсяU-образная трубка и электроды. В трубку помещается раствор компонентов белков. В зависимости от величины заряда разные белки с разной скоростью будут подходить к электродам. С помощью особого оптического устройства результаты электрофореза могут быть записаны графически – электрофореграмма (1 пик – 1 белок, 2 пика – 2 белка).

Для того, чтобы разделить белки на отдельные компоненты используют зональный электрофорез, который производится не в растворе, а в удлиненной колонке или кювете, заполненные гелем, пропитанным исследуемым раствором. Проводят разделение белков в зависимости от их заряда. С помощью элюирующего раствора их вымывают в коллектор отбора фракции.

Очень часто для того, чтобы определить какую-то аномалию белка используют метод отпечатков пальцев(филгерприн).

На хроматографической бумаге проводят по вертикали хроматографию и разделяют, а горизонтально проводят электрофорез. После проведения электрофореза каждое пятно будет на своём месте.

Чтобы узнать, какие аминокислоты содержаться в белке, надо провести гидролиз (щелочной, кислотный, ферментативный). Далее анализируют: какие и сколько.