ЛЕКЦИЯ 5 Электрофорез. Пульс-электрофорез. Блотинг.

Электрофорез применяется для разделения заряженных молекул, имеющих различные размеры.

Устройство для э.ф. состоит из камеры, в которой помещена тонкая пластина из геля, омываемая буфером, и электродов, для создания электрического поля. Ток на электроды подается от источника постоянного тока. При обычном э.ф. напряженность поля около 5 В/см. Современные камеры устроены так, что позволяют охлаждать их во время работы.

Рисунок 1. Общее устройство камеры для э/ф.

Гелевая пластинка готовится каждый раз заново и представляет собой желеобразную матрицу из длинных тонких молекул, образующих суб-микроскопические поры. Размер пор может изменяться в зависимости от химического состава геля и концентрации гель-образующего вещества.

Рисунок 2

Наиболее распространено применение агарозных и полиакриламидных гелей.

- В полиакриламидном геле можно разделить нуклеиновые кислоты, которые

отличаются по длине всего лишь на один нуклеотид, если их длина не

превышает 500 б (пар оснований).

- Используя агарозный гель, можно разделить НК до 50 кБ.

- Гель электрофорез в пульсирующем поле (пульс-электрофорез) или

с инверсией электрического поля позволяет разделить нуклеиновые

кислоты до 10 Мб.

При электрофорезе отрицательно заряженные фрагменты ДНК движутся по направлению к положительному полюсу со скоростью, обратно пропорциональной их длине, поскольку более длинные молекулы будут сильнее задерживаться в порах, а меньшие по размерам проходить через поры более свободно, в результате через определенное время фрагменты разной длины будут разделены в соответствии с их размерами. Существует логарифмическая связь между размерами фрагментов ДНК и расстоянием, на которое они мигрируют в геле. После окраски геля специальными красителями фрагменты ДНК становятся видимыми в виде полос или пятен.

Следует, однако, иметь в виду, что для разделения важен не столько молекулярный вес, сколько размер и конформация молекулы. Так суперскрученные кольцевые молекулы движутся быстрее, чем кольцевые с ник-разрывами, а те, в свою очередь, быстрее, чем линейные.

5' ___________________________ 3' А

5'__________________

3'__I_I_I______ ____I Б

Обе эти молекулы имеют одинаковый молекулярный вес, но поскольку молекула Б имеет вторичную структуру, которая делает ее меньше, и она будет двигаться в геле быстрее, чем молекула Б. Чтобы предотвратить этот нежелательный эффект и образование вторичных и третичных структур, при подготовке ДНК, РНК или белков для э.ф. применяются специальные приемы.

Гель-электрофорезе в пульсирующем поле

При обычном электрофорезе при нахождении в постоянном электрическом поле большие молекулы ДНК (более 30-50 кБ) движутся с одной и той же скоростью, независимо от их размеров. Для разделения больших молекул ДНК (от 50 кБ до 10 мБ) применяется гель-электрофорезе в пульсирующем поле (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE). Такой режим помогает преодолевать поры геля даже большим молекулам ДНК. (Аналогия с ситом и подбрасыванием камней.) Предложены различные варианты пульс электрофореза, которые можно разделить на две категории.

1) В простейшем случае направление поля периодически меняется на противоположное, и молекулы ДНК движутся по прямой линии вперед-назад с паузой между двумя импульсами. Это метод с инверсией электрического поля (field-inversion gel electrophoresis, FIGE).

_______________ ^_

↑ ↓

_______________ +

2) в вариантах, относящихся ко второй категории, используются два электрических поля, включающихся попеременно под углом 96 и 120 градусов. Молекулы ДНК движутся в таких полях в обоих направлениях зигзагообразно, поэтому траектория их движения искривлена. Такой способ позволяет разделять ДНК в более широком диапазоне размеров и быстрее, чем при FIGE. Для этого способа разделения ДНК требуется более сложное оборудование, а также мягкие методы подготовки образцов ДНК, предотвращающие ее разрывы.

(Пульс –электрофорез применяется при создании физических карт, определения числа и размеров хромосом («электрофоретическое кариотипирование») дрожжей, грибов и паразитов-возбудителей (малярии).

Для э.ф. двунитевых молекул ДНК чаще используют 50 мМ трис-боратный буфер (TBE), рН 7.5-7.8, а разделение однонитевых ДНК производят в денатурирующих условиях (NaOH в агарозном геле и мочевина или формамид в полиакриламидном геле).

Для окраски ДНК или РНК применяют этидиум бромид (EtBr), который флуоресцирует при облучении УФ-светом. Этот краситель относится к категории интеркалирующих веществ, которые вклиниваются в ДНК.

Следует проявлять максимальную осторожность и аккуратность при контакте с EtBr, поскольку он является сильным канцерогеном.

После окрашивания EtBr пластинки рассматривают и фотографируют в темной комнате, пользуясь т.н. УФ-трансиллюминаторами. Современные трансиллюминаторы совмещены с компьютерами, которые позволяют сразу же сфотографировать пластинку и количественно оценить результаты разделения и занести данные в память компьютера.

Для оценки размеров ДНК в качестве маркеров используют рестрикты ДНК фага лямбда, размеры которых хорошо установлены, и для них используют одну или две дорожки на гелевой пластинке. Маркеры продаются.

Электрофорез в полиакриламидном геле. SDS-PAGE

PAGE – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Цель этого метода - разделение белков из смеси согласно их размерам. Белки, как известно, имеют вторичную, третичную и четвертичную структуру. Поэтому при электрофорезе они будут разделяться как по размеру, так и по форме. Чтобы сделать белки одинаковыми по форме, их обрабатывают SDS- Sodium Dodecyl Sulfate – денатурирующим детергентом, который может растворять гидрофобные молекулы и имеет негативный заряд (сульфат). Действуя на белки SDS 1) разрушает гидрофобные области и 2) покрывает белок множеством негативных зарядов. В результате все белки денатурируется до своей первичной структуры и становятся линеаризованными, а также могут теперь двигаться в электрическом поле к положительному электроду.

При обработке целых клеток SDS разрушает клеточные мембраны и затем солюбилизирует белки (т.е. переводит их в растворимое состояние).

Рисунок.

После обработки SDS белки разделяют, применяя PAGE- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis. ПАГ по своей структуре напоминает лабиринт из тоннелей различного диаметра, образованных случайным образом нитями полимера.

Рисунки

БЛОТИНГ

После того как ДНК, РНК или белки разделены, они должны быть перенесены на твердую подложку для детекции и других операций, которые в геле идут с трудом. Процесс переноса, приводящий к иммобилизации молекул, т.е. закреплению в неподвижном состоянии, называется блотингом (на руском языке с одним «т»; по англ. – blotting). В качестве подложки используются нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны. Перенос на мембрану может быть осуществлен двумя путями.

1. Капиллярный блотинг.

Блотинг по Саузерну (Southern blot) используется для извлечения ДНК из геля. В этом случае молекулы переносятся из гелевой пластинки потоком буфера от слоя из мокрой фильтровальной бумаги к слою из сухой бумаги и задерживаются на мембране. Гель помещают на фильтровальную бумагу, находящуюся в контакте с буфером. Мембрану из нитроцеллюлозы или нейлона накладывают сверху на гель, а сверху накладывают несколько слоев фильтровальной бумаги, которая служит в качестве капиллярного насоса, вымывая фрагменты ДНК током буфера из геля в мембрану. Далее ДНК денатурируют щелочью, а мембрану выдерживают при 80 градусах или облучают УФ-светом для фиксации ДНК на мембране. Затем мембрану помещают в раствор с меченым зондом и происходит гибридизация. После отмывки результаты выявляют с помощью радиоавтографии.

Рисунок

РНК плохо связывается с обычными нитроцеллюлозными и нейлоновыми фильтрами, поэтому применяют специальные нейлоновые фильтры, а перед иммобилизацией РНК денатурируют диметилсульфоксидом, формальдеги-дом и др. По аналогии с блотингом по Саузерну (южный) этот вид блотинга был назван нозерн (northern-южный). Соответственно метод переноса белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозные или нейлоновые мембраны был назван вестерн (Western-восточный).

2. Электроэлюирование. В приведенных выше случаях молекулы ДНК движутся под действием капиллярных сил. Если переносимые молекулы имеют отрицательный заряд (как ДНК) может применяться электроэлюирование с помощью электрофореза. Пластинка геля помещается в буферный раствор между двумя электродами, а между анодом (+) и пластинкой вкладывается нитроцеллюлозная мембрана. В электрическом поле отрицательно заряженные молекулы ДНК движутся к аноду и задерживаются на мембране. Еще в одном варианте в качестве движущей силы используется вакуум.

Рисунок

В качестве пробы для определения определенного белка используют антитела, поэтому этот метод называют также иммуноблотингом.