Лабораторная работа выделение, очистка и количественное определение белков
Цель работы – освоение методов выделения белков из биологического материала и их очистки, а также методов определения количества белка.
Реактивы, материалы и оборудование: зеленый горошек; дистиллированная вода; оксид алюминия; 0,01 М трис-глициновый буферный раствор (рН 8,3); 0,01 М трис-глициновый буферный раствор (рН 8,3), содержащий 0,1% тритона Х-100 и 1 · 10−3 М дитиотреитола; насыщенный (100%-ный) раствор сульфата аммония; сульфат аммония; физиологический раствор (0,85%-ный раствор NaCl); физиологический раствор, содержащий 0,1% тритона Х-100 и 1 · 10−3 М дитиотреитола; реактивы для количественного определения белка биуретовым методом, методами Лоури, Бредфорда; шпатели; фильтровальная бумага; ступки; стеклянные палочки; центрифужные пробирки; пипетки на 1, 2, 5, 10 мл; автоматические пипетки на 200 и 1000 мкл; химически чистые пробирки, колбы на 50 мл; мерные цилиндры на 25, 50 мл; целлофан; химический стакан на 1 л; кюветы для фотоэлектроколориметра и спектрофотометра; штативы для пробирок; электронные весы; центрифуга; ультратермостат; фотоэлектроколориметр; спектрофотометр.
Выполнение работы
Выделение нативных белков из растительного материала и их очистка от низкомолекулярных соединений
Гомогенизация биологического материала и экстракция белков. Небольшое количество (~5 г) зеленого горошка промывают дистиллированной водой, обсушивают с помощью фильтровальной бумаги, взвешивают и затем растирают в фарфоровой ступке с 3 г окиси алюминия (Аl2O3), добавляя порциями по 10−15 мл 0,01 М трис-глицинового буферного раствора (рН 8,3) до консистенции густой сметаны, в течение 10 мин. После этого гомогенат периодически перемешивают на протяжении 30 мин при комнатной температуре. Затем гомогенат центрифугируют при 5000 мин1 в течение 10 мин. Супернатант сливают в колбу, а осадок ресуспендируют в 5 мл 0,01 М трис-глицинового буферного раствора, выдерживают 15 мин и центрифугируют при тех же параметрах. Оба супернатанта объединяют и измеряют полученный объем. Это экстракт легкорастворимых белков.
Для экстракции труднорастворимых белков осадок, полученный после второго центрифугирования, ресуспендируют в 10 мл 0,01 М трис-глицинового буферного раствора (рН 8,3), содержащего 0,1% тритона Х-100 и 1 · 10−3 М дитиотреитола, выдерживают 15 мин и центрифугируют при 5000 мин1 в течение 10 мин. Процедуру повторяют еще раз. Супернатанты объединяют и измеряют полученный объем.
Высаливание белков.Экстракты легко- и труднорастворимых белков предварительно охлаждают в холодильнике. 5 мл белкового раствора смешивают с равным объемом насыщенного (100%-ного) раствора сульфата аммония, перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем к раствору маленькими порциями при перемешивании добавляют сухой, мелко растертый в ступке порошок сульфата аммония до 80%-ного насыщения (уравнение (3.12) или таблица в приложении), причем каждую последующую порцию вносят после растворения предыдущей. После растворения последней порции сульфата аммония смесь оставляют на 10 мин, после чего осадок белков отделяют центрифугированием при 12 000 мин1 в течение 20 мин. Супернатант замораживают. Осадок белков растворяют в 2−5 мл физиологического раствора, содержащего 0,1% тритона Х-100 и 1 · 10−3 М дитиотреитола.
Количество сульфата аммония в граммах, которое нужно добавить к 1 л раствора при 20°С, чтобы из раствора с насыщением S1 получить раствор с насыщением S2, рассчитывают по формуле
(3.12)
где СА – количество сульфата аммония (твердого), г; S2 – требуемая степень насыщения раствора, %; S1 – исходная степень насыщения раствора, %.
В данном случае принимают, что раствор сульфата аммония 100%-ного насыщения соответствует 4,05 М раствору.
Диализ белковых растворов. Белковые растворы, полученные на предыдущей стадии, переносят в целлофановые мешочки, которые завязывают и помещают в стакан с 1 л физиологического раствора таким образом, чтобы уровни жидкости в мешочках и стакане совпадали. Диализ проводят в холодильнике в течение суток. После этого диализованные белковые растворы замораживают.