2. Выделение из клеток пекарских дрожжей фракций, обогащенных алкогольдегидрогеназой

Биомассу дрожжей размораживают, ресуспендируют ее в 20 мл 2%-ного раствора K₂НРО₄ и выдерживают при температуре 37°С в течение 3 ч, периодически перемешивая до получения однородной суспензии. Затем колбу с суспензией помещают в ультратермостат при 55°С на 15−20 мин и содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой. После этого суспензию быстро охлаждают в ледяной бане и центрифугируют при 2°С и 15 000 мин^1 в течение 30 мин.

Осадок выбрасывают, а супернатант обрабатывают охлажденным до −5°С ацетоном из расчета 5 мл на каждые 10 мл дрожжевого экстракта. Полученную суспензию центрифугируют при −5°С и 15 000 мин^1 на протяжении 5 мин. Осадок выбрасывают, а к супернатанту добавляют еще 5,5 мл охлажденного ацетона на каждые 10 мл дрожжевого экстракта.

Полученную суспензию центрифугируют при −5°С и 15 000 мин^1 в течение 20 мин, осадок растворяют в 1 мл холодной дистиллированной воды и диализуют против 1 л 10 мМ K-фосфатного буферного раствора (рН 7,5) в течение 12 ч. Диализованные белковые растворы замораживают.

3. Определение активности алкогольдегидрогеназы

Диализованные белковые растворы размораживают, в случае наличия возможного осадка центрифугируют при 12 000 мин^1 в течение 10 мин и после предварительного разбавления определяют в них концентрацию белка одним из описанных в разделе 3.3 методов, а также активность алкогольдегидрогеназы.

В спектрофотометрическую кювету (l = 1 см) помещают реакционную смесь, содержащую:

• 0,3 мл 60 мМ Na-пирофосфатного буферного раствора (рН 8,5);

• 2,5 мл дистиллированной воды;

• 0,1 мл 15 мМ раствора НАД (рН 6,0);

• 0,1 мл 3 М раствора этанола.

Реакцию запускают добавлением 0,05 мл раствора АДГ. Общий объем пробы составляет 3 мл. Содержимое кюветы перемешивают и измеряют увеличение экстинкции раствора при 340 нм в течение 45−60 с на спектрофотометре Specord M-40 с помощью специальной кинетической программы. С помощью программного обеспечения прибора проводится расчет величины начальной скорости реакции – тангенса угла наклона касательной к кинетической кривой в нулевой точке (изменение экстинкции в секунду E/S).

Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение E/S.

Величину удельной активности АДГ вычисляют по формуле

(4.9)

где А – удельная активность АДГ, мкмоль/(мин · мг белка); E/S – изменение экстинкции в единицу времени, с^1; 60 – количество секунд в 1 мин; V₁ – объем инкубационной смеси, мл; С – концентрация белка, мг/мл; V₂ – объем внесенного раствора АДГ, мл;  − коэффициент молярной экстинкции НАДН · Н⁺, М^1 · см^1; l – толщина кюветы, см; 10³ – количество миллилитров в 1 л; 578,8 – коэффициент пересчета, учитывающий известные величины.

Сравнивают величины удельной активности АДГ, выделенной из клеток дрожжей, подвергшихся и не подвергшихся действию сульфата меди (при условии одинаковой концентрации белка), и делают вывод о влиянии ионов Cu²⁺ на активность фермента.