Параметры ферментативных реакций для определения пероксидазной активности
|
Субстрат пероксидазного окисления |
Концентрация перекиси водорода, мМ |
Концентрация окисляемого субстрата, мМ |
Концентрация белка, мкг/мл |
рН |
|
о-Дианизидин |
|
|
|
|
|
Гваякол |
|
|
|
|
|
Конифериловый спирт |
|
|
|
|
Реакция пероксидазного окисления о-дианизидина представлена на схеме:
Как ферментативное, так и неферментативное окисление о-дианизидина (3,3'-диметоксибензидина или 4,4'-диамино-3,3'-диметоксибифенила) при значениях рН, близких к нейтральным, приводит к образованию конечного продукта бис-(3,3'-диметокси-4-амино)-азобифенила (соединение 2). Это соединение образуется при конденсации двух молекул 4,4'-диимино-3,3'-диметоксибифенила (соединение 1), который является первичным продуктом окисления о-дианизидина.
Реакция пероксидазного окисления кониферилового спирта представлена на схеме:
Гваякол в реакции перекисного окисления полимеризуется с образованием тетрагваякола.
Лабораторная работа № 1 определение активности алкогольдегидрогеназы в дрожжевых экстрактах
Цель работы – освоение методов выделения алкогольдегидрогеназы из клеток пекарских дрожжей и определения ее активности; изучение влияния тяжелых металлов на активность фермента.
Реактивы, материалы и оборудование: пекарские дрожжи (прессованные, 75%-ной влажности); дистиллированная вода; физиологический раствор (0,85%-ный раствор NaCl); физиологический раствор, содержащий 2% глюкозы; 30%-ный раствор CuSO4 · 5H2O; оксид алюминия; 2%-ный раствор К2НРО4; ацетон; 10 мМ K-фосфатный буферный раствор (рН 7,5); 60 мМ Na-пирофосфатный буферный раствор (рН 8,5); 15 мМ раствор НАД (рН 6,0); 3 М раствор этанола; лед; шпатели; ступки; стеклянные палочки; центрифужные пробирки; целлофан; химический стакан на 1 л; пипетки на 1, 2, 5, 10 мл; автоматические пипетки на 200 и 1000 мкл; колбы Эрленмейера объемом 250 мл; химически чистые пробирки; конические колбы объемом 50 мл; кюветы для спектрофотометра; штативы для пробирок; электронные весы; установка УВМТ-12-250; ультратермостат; центрифуга; спектрофотометр.
Выполнение работы
1. Подготовка биологического материала
5 г пекарских дрожжей (прессованных, 75%-ной влажности) ресуспендируют в 70−80 мл физиологического раствора с глюкозой (2%) и инкубируют в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на установке УВМТ-12-250 в условиях аэрации (200 мин1) при 30°С в течение 1,5−2,0 ч для активации клеток. Используют две колбы: контрольную и опытную. Культуральную жидкость центрифугируют (5000 мин1, 15 мин) и дрожжевую массу дважды отмывают от глюкозы путем последовательного ее ресуспендирования в физиологическом растворе и центрифугирования клеточной суспензии (5000 мин1, 15 мин).
Затем биомассу дрожжей из контрольной колбы ресуспендируют в 70−80 мл физиологического раствора, а биомассу дрожжей из опытной колбы – в 70−80 мл физиологического раствора, содержащего CuSO4 · 5H2O в концентрации 0,5; 1,0; 2,0 или 4,0%. Дрожжи инкубируют в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на установке УВМТ-12-250 в условиях аэрации (200 мин1) при 30°С в течение 1,5−2,0 ч. Культуральную жидкость центрифугируют (5000 мин1, 15 мин), а дрожжевую массу из опытной колбы дважды отмывают от сульфата меди путем последовательного ее ресуспендирования в физиологическом растворе и центрифугирования клеточной суспензии (5000 мин1, 15 мин). Сырую биомассу замораживают.