Fiziologicheskie_osnovy_povedenia / ФИЗИОЛОГИЯ Практическая часть и картинки / 03_ПР3 Электрофизиол-е процессы на мембране нервных клеток

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА 3

ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Цель работы: рассмотреть электрофизиологические процессы, происходящие на мембране нервных клеток, освоить решение задач по определению мембранного потенциала

Теоретическая часть

Клеточная мембрана представляет собой тонкую (7 нм) липопротеиновую пластинку, содержание липидов в которой составляет около 40%, белков – около 60%. Изнутри клеточная мембрана выстлана тонким и более плотным слоем гиалоплазмы. На внешней поверхности мембраны расположены молекулы углеводородов и их комплексов с белками и липидами. Вместе они образуют слой, который называется гликокаликс. Углеводы участвуют в процессах рецепции активных веществ.

Рисунок 1 – Схема строения клеточной мембраны

Задание 1. Самостоятельно подпишите и выделите разными цветами основные структуры клеточной мембраны нейрона на рисунке 1.

Молекулы липидного слоя мембраны нейрона состоят из двух частей:

• гидрофильная часть – несет заряд;

• гидрофобная часть – не заряжена.

Наличие гидрофобной и гидрофильной части определяет двухслойную структуру мембраны.

В липидный слой встроены молекулы белков, которые объединены в основные классы: структурные белки, белки – переносчики, ферменты, белки образующие ионные каналы, ионные насосы и специфические белки.

Рисунок 2 – Схема липида клеточной мембраны

Задание 2. Рассмотрите строение, выделите красным цветом заряженную часть молекулы, а зеленым – не заряженную часть молекулы

Клеточная мембрана нейрона обладает свойством избирательной проницаемости: одни вещества пропускает, другие нет. В частности, мембрана легко проницаема для жиров, проникающих через липидный слой. В то же время анионы органических кислот не проходят через мембрану.

При действии нервных импульсов проницаемость мембран нейрона для различных ионов изменяется, это обеспечивает движение ионов согласно градиенту концентрации и электрическому градиенту, и выражается в возникновении возбуждающих и тормозных потенциалов.

Поступление нейтральных молекул и ионов осуществляется за счет пассивного и активного транспорта. Пассивный транспорт не связан с затратой химической энергии, он осуществляется в результате диффузии веществ в сторону меньшего электрохимического потенциала. Активный транспорт требует затрат химической энергии в виде гидролиза молекул АТФ.

Основным механизмом пассивного транспорта является диффузия, которую обусловливает наличие концентрационного градиента. Градиентом концентрации называют изменение концентрации вещества на единицу длины в направлении диффузии.

Диффузия – это самопроизвольное перемещение вещества из области с большей концентрацией в места с меньшей его концентрацией вследствие теплового движения молекул.

Различают простую и облегченную диффузию ионов. Простая диффузия характеризуется движением через ионный канал без переносчика, а облегченная с участием переносчика, увеличивающего скорость диффузии. Например, молекулы белка валиномицина облегчает диффузию ионов калия (рассмотрите рисунок 3).

Рисунок 3 – Виды диффузии

В случае облегченной диффузии, ионная проницаемость обеспечивается ионным каналом, который образован трансмембранным белком (валиномицин в случае диффузии калия). Активация такого канала обусловлена взаимодействием какого-либо участка молекулы канала с определенным химическим веществом. При взаимодействии происходит изменении конформации белковой молекулы, что приводит к переносу иона/ов через данный канал.

Конформация (от лат. conformatio — форма, построение, расположение) – это способность молекул органических соединений изменять свою геометрическую форму при сохранении химического строения, длины связи и валентных углов, в результате взаимодействия их атомов, приводящих к образованию водородных связей, сил отталкивания или притяжения.

Диффузия ионов через мембрану создает разность электрических потенциалов. Возникновение разности потенциалов обусловлено неравномерным распределением ионов между клеткой и окружающей средой. Для объяснения механизма неравномерного распределения ионов по обе стороны мембраны Фредерик Доннан предложил модель, в которой два раствора разделенные мембраной, проницаемой для воды и ионов, но не проницаема для крупных белковых молекул (рассмотрите рисунок 4).

В исходном состоянии в камере слева (а) находится раствор хлорида калия, а в камере справа (б) – протеина калия. Поскольку в камере справа ионы хлора отсутствуют, они перемещаются из камеры слева (а) в камеру справа (б) по градиенту концентрации. Движение ионов хлора смещает электронейтральность раствора и приводит к движению ионов калия, которые устремляются вслед за хлором из камеры слева (а) в камеру справа (б) для восстановления электронейтральности.

В результате, к моменту достижения равновесия в камере справа (б) проникает Х ионов хлора, а содержание ионов калия становится Св ^К+ + Х. В камере слева (а) содержание ионов калия и хлора становится равным Сн ^К+ – Х.

ВНЕШНЯЯ Сн – х = [K+]a Сн – х = [Cl-]a СТОРОНА

ВНУТРЕННЯ [K+]б = Св + х [Cl-]б = х СТОРОНА

Рисунок 4 – Движение ионов через мембрану нейрона

Ф. Доннан показал, что при равновесии произведение концентраций ионов, способных к диффузии, по обе стороны мембраны равны.

[K⁺]_б · [Cl^-]_б = [K⁺]_a · [Cl^-]_a (1)

Состояние системы, при котором выполняется это условие, называется доннановским равновесием.

После преобразования выражение (1) можно определить величину Х - равновесную концентрацию ионов, прошедших через мембрану и способных к диффузии:

[Cв^К+ + Х] · Х = [Сн^К+ – Х] · [Сн ^К+ – Х] (2)

Откуда (раскройте скобки и выразите Х)

Х = С²н^К+/(Свн ^К+ + 2Сн ^К+) (3)

Состояние равновесия Доннана возможно при условии, что по обе стороны мембраны находятся электронейтральные растворы. Однако если с одной стороны мембраны раствор электролита более концентрирован, чем с другой, то возникает поток воды, создающий осмотическое давление на клеточную оболочку. В результате увеличения величины давления клеточная оболочка может быть повреждена, что ведет к гибели клети. Для предотвращения этого в процесс эволюции был выработан следующий механизм: недостаток электролитов в наружной среде компенсируется присутствием соли NaCl.

Мембрана малопроницаема для ионов натрия, поэтому ионы натрия, окружающие клетку, являются основным фактором, уравновешивающим осмотическое давление.

Мембранный потенциал (φ_м^ПП), обусловленный переносом ионов калия можно определить с помощь уравнения Нернста для калия¹:

φ_м^ПП = - 2,3 · (RT/F) · lg([K⁺]в / [K⁺]н) (4)

где [K⁺]н и [K⁺]в – молярные концентрации ионов по обе стороны мембраны, R – универсальная газовая постоянная (8,31 Дж/(моль · К)), Т – температура, градусы Кельвина (T=273+t), F – постоянная Фарадея (96500 Кл/моль), Z – заряд иона.

Большая часть ионов калия в цитоплазме нервной клетки находится в свободном состоянии. Используя метод меченных изотопов (⁴²К) было установлено, что не менее 90% внутриклеточного калия свободно диффундирует и перемещается через мембрану клетки. Учитывая то, что внутри клетки концентрация ионов калия в 10-20 раз больше, чем снаружи, происходит диффузия этих ионов, которая определяет формирование мембранного потенциала (биопотенциала мембраны).

Восстановление внутриклеточной концентрации ионов калия происходит в результате активного транспорта, посредством работы транспортной системы – фермента Na, K-ATФ-азы, которая откачивает ионы натрия из клетки и закачивает ионы калия в клетку за счет энергии гидролиза молекул АТФ.

Активный транспорт – это перенос вещества из мест с меньшим значением электрохимического потенциала в места с его большим значением, т.е. против градиента концентрации, с затратой энергии (АТФ).

Рисунок 5 – Схема строение Na, K-ATФ-азы

Na, K-ATФ-аза – это комплекс липопротеинов, функции которого связаны с конформационными перестройками молекул его образующих.

Na, K-ATФ-аза состоит из двух α- и двух β-субъединиц. Субъединица α осуществляет гидролиз АТФ, а субъединица β переносит ионы. В результате работы Na, K-ATФ-азы клетка возвращает 2 иона калия и выводит 3 иона натрия, поддерживая тем самым, ассиметричный перенос этих ионов, что обеспечивает дополнительное увеличение потенциала покоя на 5 – 10 мВ. Результатом процесса диффузии и активного транспорта является мембранный потенциал покоя.

Потенциал покоя – это стационарная разность электрических потенциалов, регистрируемая между внутренней и наружной поверхностями мембран в невозбужденном состоянии.

В состоянии покоя клеточная мембрана проницаема для ионов К⁺ и в некоторой степени ионов Na⁺ и Cl^-.

Более точное, в сравнении с уравнение Нернста значение мембранного потенциала φ_м^ПП может быть получено с помощью уравнения Гольдмана:

где Р – коэффициенты проницаемости для соответствующих ионов.

Уравнение Гольдмана позволяет учесть одновременную диффузию через мембрану ионов К⁺, Na⁺ и Cl^-

На основании экспериментальных данных для аксона кальмара в состоянии покоя отношения коэффициентов проницаемости составили:

Р_К : Р_Na : Р_Cl = 1 : 0,04 : 0,45 (или 100 : 4 : 45)

Проницаемость мембраны для ионов натрия крайне мала, однако в небольших количествах натрий поступает в клетку. Это ведет к уменьшению потенциала покоя, т.к. на внешней поверхности число положительно заряженных частиц уменьшается, а часть отрицательного заряда внутренней поверхности нейтрализуется. Такое состояние называют процессом деполяризации.

Влияние анионов хлора на величину потенциала покоя противоположно. Ионы хлора, согласно концентрационному градиенту, стремятся в клетку, однако этому препятствует электрический градиент, поскольку заряд внутри клетки отрицательный. При поступлении анионов хлора внутрь клетки, общий отрицательный заряд на наружной поверхности мембраны уменьшается, а внутренний увеличивается, таким образом, поступающие в клетку ионы хлора увеличивают потенциал покоя мембраны нейрона, что соответствует состоянию, которое называют гиперполяризация.

Мембранный потенциал нервного волокна составляет от -70 до -90 мВ.

Практическая часть

Задача 1. Вычислить величину мембранного потенциала E калия для аксона кальмара при комнатной температуре (18 °С), если концентрация ионов калия в наружной и внутренней среде равна соответственно 40 и 400 ммоль/л.

Задача 2. Определите потенциал покоя для ионов а) калия, б) натрия, с) хлора аксона кальмара при температуре 23°С, если концентрация ионов соответствует следующим значениям приведенным в таблице 1.

Таблица 1 – Соотношение концентраций трансмембранных ионов, ммоль/л

[K+]		[Na+]		[Cl-]
внутренняя	наружная	внутренняя	наружная	внутренняя	наружная
360	10	70	420	160	500

Задача 3. Определите потенциал покоя мембраны мышечной клетки лягушки для ионов а) калия, б) натрия, с) хлора при температуре 20°С, если концентрация ионов соответствует следующим значениям приведенным в таблице 2.

Таблица 2 – Соотношение концентраций трансмембранных ионов, ммоль/л

[K+]		[Na+]		[Cl-]
внутренняя	наружная	внутренняя	наружная	внутренняя	наружная
125	2,5	15	125	11	120

Задача 4. Определите значение мембранного потенциала, учитывая одновременную диффузию через мембрану ионов К⁺, Na⁺ и Cl^- для условия задачи 2 и 3.

Задача 5. Определите значение мембранного потенциала калия для аксона нейрона человека, если концентрация ионов снаружи 4 ммоль/л, а внутри клетки 140 ммоль/л. Как измениться значение мембранного потенциала, если понизить, или повысить температуру на 5, 10, 15 °С.

Задача 6. Концентрация ионов (ммоль/л) между двумя сторонами клеточной мембраны в аксоне кальмара имеет следующее значение: Na⁺ (н 460 / в 50), К⁺ (н 10 / в 400), Cl^- (н 540 / в 100), Ca²⁺ (н 10 / в 0,4), Mg²⁺ (н 53 / в 10). Определить разность потенциалов на мембране для каждого типа ионов, при температуре 37°С.

Контрольные вопросы:

1. Расскажите о строении мембраны нервных клеток.

2. Какие виды транспорта молекул и ионов вы можете перечислить?

3. Что такое концентрационный градиент?

4. Что такое диффузия?

5. Чем определяется различие простой и облегченной диффузии?

6. Объясните механизм неравномерного распределения ионов по разные стороны биологической мембраны. Что такое равновесие Доннана?

7. Как определить диффузный потенциал мембраны клетки?

8. Что такое Na, K-ATФ-аза? Опишите строение и расскажите о значении этой молекулы.

9. Дайте определение потенциала покоя клетки.

10. Какое значение в формировании потенциала покоя играют ионы натрия и хлора?

1 ln X = 2.302 lg X; lg X = 0.434 ln X