biohimiyа

Опыт 2. Качественная реакция на желчные кислоты.

Приборы. 1. Предметное стекло.

2.Стеклянная палочка.

5.Набор пипеток.

Реактивы. 1. Желчь.

2.Сахароза, 20%-ный раствор.

3.Серная кислота, концентрированная.

1.На сухое предметное стекло нанесите 1 каплю желчи (разведена водой

в2 раза) и 1 каплю 20%-ного раствора сахарозы.

2.Перемешайте стеклянной палочкой. Рядом нанесите каплю концентрированной серной кислоты.

3.Через некоторое время (10-15 мин) на месте слияния капель появляется красное окрашивания, переходящего при стоянии в красно-фиолетовое.

Где и из чего синтезируются в организме желчные кислоты? Какую роль желчные кислоты играют в переваривании и всасывании липидов?

Опыт 3. Определение концентрации общих липидов в сыворотке крови.

Для количественного определения общих липидов в сыворотке крови чаще всего пользуются колориметрическим методом с фосфованилиновым реактивом. Общие липиды взаимодействуют после гидролиза серной кислотой с фосфованилиновым реактивом с образованием красного окрашивания. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

1. В три пробирки внесите реактивы по следующей схеме:

Перемешать и поставить на кипящую водяную баню на 20 мин. Затем охладить проточной холодной водой. Отобрать аликвоты гидролизатов в сухие пробирки.

61

2.Содержимое пробирок перемешайте, оставьте в темноте на 40-60 мин. (цвет раствора меняется с желтого на розовый).

3.Снова перемешайте и измерьте оптическую плотность при 500-560 нм (зеленый светофильтр) против слепой пробы в кювете толщиной слоя 5 мм.

4.Рассчитайте количество общих липидов по формуле:

Концентрац ия общих липп идов D1 х X г/л

D2

где D1 – экстинкция опытной пробы в кювете;

D2 – экстинкция калибровочного раствора липидов в кювете; Х концентрация общих липидов в стандартном растворе.

Дайте определение понятия «общие липиды». Сравните полученное Вами значение с нормальными величинами. О каких биохимических процессах можно судить по данному показателю?

Опыт 4. Определение содержания - и пре- -липопротеинов в сыворотке

крови.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянная палочка.

4.ФЭК.

5.Кюветы, 0,5 см.

Реактивы. 1. Сыворотка крови.

2.Хлорид кальция, 0,025М раствор.

3.Гепарин, 1%-ный раствор.

4.Дистиллированная вода.

1.В пробирку налейте 2 мл 0,025 М хлористого кальция и добавьте 0,2 мл сыворотки крови.

2.Тщательно перемешайте и измерьте оптическую плотность пробы (D1) на ФЭК-е при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете

столщиной слоя 0,5 см против дистиллированной воды. Запишите значение оптической плотности D1.

3.Затем в кювету добавьте 0,04 мл 1%-го раствора гепарина (1000ЕД в 1 мл), тщательно перемешайте стеклянной палочкой и точно через 4 мин вновь измерьте оптическую плотность D2.

62

Разница значений (D2 – D1) соответствует оптической плотности, обусловленной осадком -липопротеинов.

Рассчитайте содержание - и пре- -липопротеинов по формуле:

Содержание липопротеинов, г/л = (D2 – D1) 12,

где 12 – коэффициент для перевода в г/л.

Укажите место биосинтеза -липопротеинов. Какую функцию они выполняют в организме человека и животных? Сравните полученное Вами значение с нормальными величинами. В каких случаях наблюдаются отклонения от нормальных величин?

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 16. «Обмен липидов (часть 2)»

Цель занятия: изучить процессы катаболизма и анаболизма жирных кислот.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Биохимический механизм окисления жирных кислот.

2.Обмен кетоновых тел: образование, биохимическое назначение. Какие факторы предрасполагают к появлению кетозов у животных?

3.Биохимический механизм синтеза жирных кислот.

4.Биосинтез фосфолипидов и триацилглицеридов.

5.Регуляция и нарушения липидного обмена.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

63

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Экспресс метод определения кетоновых тел в моче, молоке, сыворотке крови (проба Лестраде).

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянная палочка.

4.Фильтровальная бумага.

Реактивы. 1. Порошок реактивов. 2. Моча.

3.Сыворотка крови.

4.Молоко.

1.На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля поместите небольшое количество (0,1-0,2 г) порошка реактивов.

2.Несколько капель сыворотки крови перенесите на порошок реактивов.

3.Результаты теста оцените через 5 минут.

Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно - содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту - в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел.

Следует помнить, что тест более чем в 3 раза чувствительнее при определении ацетоуксусной кислоты, чем ацетона. Из всех кетоновых тел в сыворотке крови человека ацетоуксусная кислота является преобладающей, однако в крови здоровых коров 70-90% кетоновых тел составляет -оксимасляная кислота, в молоке на ее долю приходится 87-92%.

Сделайте вывод по результатам Вашего исследования. Объясните, чем опасно избыточное образование кетоновых тел в организме человека и животных?

Опыт 2. Определения видовой принадлежности жира по температуре плавления жира.

Определение температуры плавления является наиболее простым и доступным методом определения видовой принадлежности жира. Метод основан на том, что температура плавления наружного и внутреннего жира животных разных видов является строго специфичным и стабильным показателем

Приборы. 1. Фарфоровая чашка.

2.Капилляры стеклянные.

3.Холодильник.

4.Термометр.

64

5.Химический стаканчик, 150-250 мл.

6.Штатив.

7.Стеклянная палочка.

Реактивы. 1. Жир животный.

1.Исследуемый жир поместите в фарфоровую чашку, вытопите его на горелке и наберите в прозрачные стеклянные капилляры диаметром 1,5 мм. Высота столбика жира должна быть 5-7 мм.

2.Капилляры с жиром поместите в холодильник на 1-2 часа.

3.После охлаждения капилляр с жиром при помощи резинки закрепите на термометре таким образом, чтобы столбик жира был на одном уровне с головкой термометра.

4.Термометр вместе с капилляром закрепляют на штативе и опустите в прозрачный химический стакан, наполненный водой и стоящий на электрической плитке, таким образом, чтобы верхняя часть капилляра была выше поверхности воды.

5.Начинайте нагревать воду, помешивая ее стеклянной палочкой. Нагревание продолжайте до тех пор, пока столбик жира не станет прозрачным и под давлением воды станет подниматься вверх по капилляру. В этом момент снимают показатель термометра.

6.Измерение повторите пять раз и найдите среднее арифметическое.

Полученный результат считают температурой плавления исследуемого жира. Данные о температуре плавления жира приведены в таблице.

На основании полученных результатов сделайте вывод.

65

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Искусственные полупроницаемые мембраны.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянные палочки.

Реактивы. 1. Силикатный клей.

2.Дистиллированная вода.

3.Безводный хлористый кобальт.

4.Безводная хлористая медь.

1.Для приготовления раствора силикатного клея налейте в пробирку 1 мл клея и 3 мл воды. Тщательно перемешайте содержимое стеклянной палочкой.

2.В пробирку бросьте кристаллики безводного хлористого кобальта и хорошо встряхните (не перемешивать!), для того, чтобы кристаллы опустились на дно пробирки.

3.То же проделайте с кристаллами безводной хлористой меди.

Объясните причину наблюдаемого роста дендроидных образований.

__________________________________________________________________

Опыт 2. Количественное определение концентрации общего холестерина

всыворотке крови по методу Илька.

Воснову метода положена модифицированная Ильком реакция ЛиберманаБурхарда, реактив которого дает изумрудное окрашивание с холестерином.

1.В три пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:

2.Содержимое пробирок перемешайте и на 20 минут поместите в термостат при температуре 37°С.

67

3.Измерьте оптическую плотность при длине волны 650 им (красный

светофильтр) опытной пробы против контрольной (D1) и калибровочной пробы против контрольной (D2).

4.Расчет ведут по следующей формуле:

СD1 Хммоль / л ,

D2

где С – концентрация холестерина;

X - содержание холестерина в калибровочном растворе, ммоль/л

Сравните полученное значение с физиологическими нормами и сделайте вывод.

Опыт 3. Выделение холестерина из мозга и качественные реакции на холестерин.

Приборы. 1. Весы.

2.Ступка для растирания.

3.Скальпель.

4.Предметное стекло.

5.Газовая горелка.

6.Бумажный фильтр.

7.Стеклянная воронка.

8.Стеклянная палочка.

Реактивы. 1. Мозг.

2.Хлороформ.

3.Серная кислота, концентрированная.

4.Уксусный ангидрид.

1.Взвесьте 3-5 г мозга.

2.Поместите его в ступку.

3.Разотрите мозг с двумя частями (приблизительно) гипса до получения густой кашицы.

4.При помощи лопаточки или скальпеля распределите кашицу тонким слоем на предметном стекле и высушите при 60°С (для чего стекло держите высоко над пламенем горелки).

5.Высушенную массу соскоблите в сухую пробирку и залейте 5-6 мл хлороформа.

6.Через 5-10 минут экстракт отфильтруйте в сухую пробирку через сухой фильтр.

68

7.Полученный раствор разделите на 2 пробирки и с ними проделайте качественные реакции на холестерин: реакцию Сальковского и реакцию Либермана-Бурхарда.

а) Реакция Сальковского.

1.К 1 мл хлороформного экстракта из мозга добавьте 1 мл концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешайте.

2.Поставьте пробирку на некоторое время в штатив для расслоения смеси.

3.Отметьте изменение цвета верхнего и нижнего слоев.

б) Реакция Либермана-Бурхарда.

1.К 1 мл хлороформного экстракта из мозга добавьте 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты.

2.Перемешайте.

3.Отметьте постепенное изменение окраски раствора.

Объясните принципы выделения холестерина из биологических объектов. Какую роль играет холестерин в клеточных мембранах?

Опыт 4. Действие каталазы крови на пероксид водорода.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Ступка с пестиком.

4.Весы.

Реактивы. 1. Кровь.

2.Печень.

3.Перекись водорода, 2%-ный раствор.

4.Дистиллированная вода.

1.В пробирку налейте 2 мл дистиллированной воды. Добавьте 2 капли крови и 1 каплю 1%-ного раствора перекиси водорода.

2.В другую пробирку налейте 2-3 мл свежего молока. Добавьте 2 мл перекиси водорода.

3.В третью пробирку поместите 0,3-0,5 г растертой печени. Добавьте 10

69

мл дистиллированной воды. Перемешайте содержимое. Добавьте перекись водорода.

Объясните наблюдаемые явления. Почему каталаза широко распространена и содержится в большем или меньшем количестве во всех тканях и жидкостях организма?

Опыт 5. Восстанавливающая способность витамина С.

Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Витамин С, 0,01%-ный раствор.

2.Метиленовая синь, 0,02%-ный раствор.

1.В пробирку налейте 5 мл свежеприготовленного 0,01%-ного раствора витамина С.

2.Добавьте 0,5 мл 0,02%-ного раствора метиленовой сини.

3.Содержимое пробирки энергично встряхивайте при сильном освещении.

4.Через 10-15 минуты раствор становится бесцветным.

Объясните результаты опыта. Какова биохимическая роль витамина С? Каким образом клетки животных используют восстанавливающую способность витамина С?

Дата выполнения________Балл_______Подпись преподавателя____________

70