Практикум по генетике

-все аминокислоты, кроме двух кодируются более чем одним кодоном

-сигналом остановки синтеза белка служат 3 кодона:

UAA, UAG, UGA (стоп-кодоны)

-кодон AUG является стартовым кодоном и кодирует аминокислоту метионин

-код устроен так, что при замене нуклеотидов в кодоне в белок включается родственная аминокислота

-в кодонах кодирующих одну аминокислоту, наиболее часто варьирует третий нуклеотид

Кодоны мРНК узнаются соответствующими аминокислотами с помощью «адаптеров» - небольшой молекулы РНК – транспортной (рис. 5.

13).

Рис. 5.13. Молекулы тРНК обеспечивают соответствие между кодоном

и аминокислотой (из http://library.thinkquest.org/C004535/rna_translation.html с

модификациями).

202

Молекулы тРНК принимают конфигурацию в виде кленового листа,

которая в свою очередь упаковывается в более сложную – L-форму (рис. 5.

14).

TψC -

Рис. 5.14. Трехмерная структура транспортной РНК (J. Watson et.al., 1998).

С помощью особого фермента – аминоацил-тРНК-синтетазы молекула тРНК ковалентно соединяется с аминокислотой. Для функционирования тРНК важен ещѐ один участок, называемый антикодон.

Он будет узнавать кодон на мРНК. Каждая тРНК несет аминокислоту,

соответствующую ее антикодону.

Во всех клетках имеются рибосомы, играющие ключевую роль в синтезе белка; их число колеблется от 20 до 50 тысяч. Рибосома прокариот состоит из двух субъединиц: малой (30S) и большой (50S). Когда рибосома не синтезирует белок она диссоциирована на две 2 субъединицы (рис.

5.15).

В рибосоме выделяют два участка:

P – участок – в нем связана молекула тРНК присоединеная к растущей белковой цепи.

А – участок связывает тРНК несущую следующую аминокислоту.

203

Считывание мРНК начинается с кодона AUG, который обозначает

5’-конец кодирующего участка мРНК.

Далее трансляция продолжается в направлении 5’- 3’ кодон за кодоном до тех пор, пока не достигнет стоп-сигнала.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Опишите процесс трансляции у прокариот. Участники процесса трансляции.

2.Что такое генетический код? Особенности генетического кода.

3.Решите задачу:

имеется последовательность нуклеотидов двухцепочечной ДНК. Этот фрагмент является началом гена, содержащим точку начала трансляции.

Обозначьте матричную цепь ДНК, определите последовательность транскрибируемой матричной РНК. Установите полярность последовательности ДНК.

GCTACGGATTGCTG

CGATGCCTAACGAC

4. Для данного фрагмента ДНК напишите последовательность РНК и определите точку начала трансляции.

3’ TACTACCTTAGGCTCGCCTCT 5’

5.Данный фрагмент ДНК является началом прокариотического гена.

Стрелкой обозначена точка начала транскрипции. Укажите стартовый

кодон. Определите матричную цепь.

205

5’ CCAGGTATAATGCTCCAGTATCGCATGGTACTTCCGG 3’

3’ GGTCCATATTACGAGGTCATAGCGTACCATGAAGGCC 5’

6. Определить последовательность аминокислот в начале цепочки белковой молекулы (приложение 2), если она закодирована в ДНК так:

АТГ ГТГ ГАГ ГГГ ТТЦ (табл. 5.1).

5.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР - быстрый и эффективный метод, позволяющий в пробирке получить множество копий небольших участков ДНК. Полимеразная цепная реакция, изобретенная в середине 80-х годов имела революционное значение для молекулярной биологии, медицинской диагностики,

судебной эксперизы, эволюционной биологии, дала новые подходы для изучения и анализа генов. ПЦР изменила все это, дав возможность получать огромное количество копий специфичных последовательностей ДНК без возврата к клонированию в биологических объектах.

Вследствие большой эффективности и широты применения, ПЦР является важнейшим инструментом для любых исследований в молекулярной биологии. В последнее время значительные успехи были сделаны в развитии и использовании ПЦР, которые обладают увеличенным выходом, точностью копирования, чувствительности и специфичности.

В ПЦР используются особенности репликации ДНК: копирование ДНК в пробирке осуществляет фермент ДНК-полимераза, копируемые участки определяют с помощью искусственно синтезированных затравок

(праймеров). Обе нити ДНК могут служить как матрица для синтеза, если олигонуклеотидные праймеры подобраны для каждой нити. Для ПЦР праймеры выбираются так, чтобы фланкировать регион, который будет

206

амплифицироваться. Однонитевую ДНК – субстрат для ДНК-полимеразы получают путем нагревания реакционной смеси до 95 0С (рис. 5.16). ПЦР реакция включает в себя 3 этапа:

Денатурация – на этом этапе, при температуре 950С, ДНК-матрица расплетается;

Отжиг праймеров – на этом этапе праймеры гибридизуются с матричной ДНК, создавая затравки;

Элонгация – на этом этапе, при температуре 720С, ДНК-полимераза синтезирует новые цепи.

Температура отжига праймеров, а также время, который длится каждый из этапов подбираются эмпирически, в зависимости от многих факторов, например нуклеотидного состава праймеров и длины амплифицируемого фрагмента. При постановке ПЦР реакции в отдельную пробирку вносят следующие компоненты: бидистилированная вода; смесь

4 нуклеотидов; праймеры; буфер для проведения ПЦР; ДНК-полимераза;

ДНК-матрица.

Рис. 5.16. Реакция ПЦР состоит из трех этапов

207

ПЦР проводится автоматически в специальном приборе, который называется амплификатор. Повторяющиеся циклы денатурации, отжига праймеров и элонгации приводят к быстрой амплификации специфического участка ДНК. После 22 циклов от одной молекулы ДНК-

матрицы получается более миллиона ее копий.

ДНК-полимеразы в реакции ПЦР. Изначально, для проведения ПЦР реакции использовалась ДНК-полимераза из E. сoli, но этот фермент чувствителен к температуре и разрушается при температуре необходимой для денатурации ДНК. Поэтому, каждый раз необходимо было добавлять новую порцию фермента. Важное усовершенствование техники ПЦР произошло после открытия бактерий живущих в горячих источниках и имеющих ДНК-полимеразу хорошо работающую при высоких температурах. Сейчас, наиболее широко для проведения ПЦР используется ДНК-полимераза бактерии Thermus aquaticus – Taq-полимераза.

Температурный оптимум для этого фермента 720С и он остается относительно стабильным при 950С. При использовании Taq-полимеразы фермент может быть добавлен только один раз, в процессе подготовки реакционной смеси. Специфичность и чувствительность ПЦР реакции многократно повысились. Однако, Taq-полимераза обладает рядом недостатков, которые в некоторых случаях ограничивают ее применение.

Ключевым можно считать неспособность Taq-полимеразы корректировать неправильные включения нуклеотидов в растущую цепь. При встраивании неправильного нуклеотида в строящуюся цепь синтез прекращается, что делает невозможным амплификацию длинных участков ДНК. Точность

Taq-полимеразы зависит от концентрации ионов Mg2+, нуклеотидов, pH, но в среднем, частота ошибок чуть ниже, чем 1 замена на 100-300 п.н. Для устранения подобных недостатков используют ДНК-полимеразы полученные от других термостабильных бактерий. Например:

208

Факторы, влияющие на прохождение ПЦР. На протекание ПЦР реакции оказывают влияние огромное количество факторов. Ключевыми являются: нуклеотидный состав и длина праймеров; состав буфера

(концентрация ионов магния); содержание веществ, влияющих на протекание реакции.

Праймеры. Значительное влияние на специфичность реакции ПЦР оказывают праймеры. Подбор праймеров осуществляют вручную или с помощью компьютерных программ. В любом случае надо руководствоваться рядом правил:

•длина праймеров от 17 до 30 нуклеотидов (чем меньше, тем ниже специфичность)

•Содержание пар GC праймерах должно быть около 50%

•Должна отсутствовать вторичная структура у праймеров

•Праймеры не должны быть комплементарны друг другу

Кроме того, специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется температурой отжига праймеров, при которой они гибридизуются с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя затравки. Температура отжига определяется длиной праймера и

209

содержанием ГЦ-пар и приблизительно рассчитывается по следующей

формуле:

Т(отжига)= 2x (A+T) + 4x (G+С) - 5

Подбор праймеров, удовлетворяющих указанным выше условиям удобно проводить с помощью компьютерных программ. Одной из простых и доступных программ является Oligo.

Состав буфера. Буфер – это вспомогательный компонент ПЦР реакции, обеспечивающий работу Taq-полимеразы. Кроме того, от состава буфера зависит температура плавления ДНК и ряд других факторов.

Стандартный буфер для проведения реакции ПЦР приведен ниже:

700 mM Трис-HCl, pH 8.6

166 mM (NH4)2SO4,

25 mM MgCl2

1% Triton X-100

Mg2+ - образует комплексы с dNTP’s, влияет на температуру плавления ДНК;

Triton X-100 - предотвращает адсорбцию белка на стенках пробирки;

(NH4)2SO4 – стимулирует активность Taq-полимеразы;

Tris-HCl pH 8.6 –Буфер, при 72oС рН составляет ~7.5;

Надо отметить, что фирмы поставляющие ДНК-полимеразы прилагают и соответствующий буфер, оптимальный для работы данного фермента. Поэтому, для постановки ПЦР целесообразно использовать буфер входящий в комплект Taq-полимеразы.

210