Sivolob_A_V__Afanasyeva_K_S_Molekulyarna_organ

291

Shuaib, M., Ouararhni, K., Dimitrov, S., Hamicheand, A.

HJURP binds CENP-A via a highly conserved N-terminal domain and mediates its deposition at centromeres // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2010. – Vol. 107. – P. 1349-1354.

Sullivan, B.A., Blower, M.D., Karpen, G.H. Determining centromere identity: cyclical stories and forking paths // Nat. Rev. Genet. – 2001. – Vol. 2. – P. 584-596.

Torras-Llort1, M., Moreno-Moreno1, O., Azorin, F. Focus on the centre: the role of chromatin on the regulation of centromere identity and function // EMBO J. – 2009. – Vol. 28. – P. 233 7–2348.

Структура кінетохору

Casola, C., Hucks, D., Feschotte, C. Convergent domestication of pogo-like transposases into centromere-binding proteins in fission yeast and mammals // Mol. Biol. Evol. – 2008. – Vol . 25. – P. 29-41.

Cheeseman, I.M., Desai, A. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2008. – Vol. 9. – P. 33-46.

Hori, T., Amano, M., Suzuki, A., et al. CCAN makes multiple contacts with centromeric DNA to provide distinct pathways to the outer kinetochore // Cell. – 2008. – Vol. 135. – P. 1039-1052.

Joglekar, A., Bloom, K., Salmon, E.D. In vivo protein architecture of the eukaryotic kinetochore with nanometer scale accuracy // Curr. Biol. – 2009. – Vol. 19. – P. 694-699.

Nogales, E., Ramey, V.H. Structure-function insights into the yeast Dam1 kinetochore complex // J. Cell Sci. – 20 09. – Vol. 122. – P. 3831-3836.

Ohta, S., Bukowski-Wills, J.-C., Sanchez-Pulido, L., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics // Cell. – 2010. – Vol. 142.

– P. 810-821.

Ruchaud, S., Carmena, M., Earnshaw, W.C. Chromosomal passengers: conducting cell division // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2007. – Vol. 8. – P. 798-812.

Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores // EMBO J. – 2009. – Vol. 28. – P. 251 1-2531.

292

Vader, G., Medema, R.H., Lens, S.M.A. The chromosomal passenger complex: guiding Aurora-B through mitosis // J. Cell Biol.

– 2006. – Vol. 173. – P. 833-837.

Wilson-Kubalek, E.M., Cheeseman, I.M., Yoshioka, C., Desai, A., Milligan, R. A. Orientation and structure of the Ndc80 complex on the microtubule lattice // J. Cell Biol. – 2008. – Vol. 182. – P. 10551061.

Організація веретена поділу

Rieder, C.L. Kinetochore fiber formation in animal somatic cells: dueling mechanisms come to a draw // Chromosoma. – 2005. – Vol. 114. – P. 310-318.

Scholey, J.M., Brust-Mascher, I. Mogilner, A. Cell division // Nature. – 2003. – Vol. 422. – P. 746-752.

Walczak, C.E. Molecular mechanisms of spindle function // Genome Biology. – 2000. – Vol. 1. – P. 101-104.

Рух хромосом у клітині та система контролю збірки веретена поділу

Bharadwaj, R., Yu, H. The spindle checkpoint, aneuploidy, and cancer // Oncogene. – 2004. – Vol. 23. – P. 2016-20 27.

Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J.M. Mitotic force generators and chromosome segregation // Cell. Mol. Life Sci. – 2010. – Vol. 67. – P. 2231-2250.

Díaz-Martínez, L.A., Clarke, D.J. Chromosome cohesion and the spindle checkpoint // Cell Cycle. – 2009. – Vol. 8. – P. 2733-2740.

Ganem, N.J., Compton, D.A. Functional roles of poleward microtubule flux during mitosis // Cell Cycle. – 20 06. – Vol. 5. – P. 481-485.

Maresca, T.J., Salmon, E.D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal // J. Cell Sci. – 2010. – Vol. 123. – P. 825-835.

Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2002. – Vol. 3. – P. 731-741.

293

Skinner, J.J., Wood, S., Shorter, J., Englander, S.W., Black, B.E. The Mad2 partial unfolding model: regulating mitosis through Mad2 conformational switching // J. Cell Biol. – 20 08. – Vol. 183. – P. 761-768.

Sullivan, M., Morgan, D.O. Finishing mitosis, one step at a time // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2007. – Vol. 8. – P. 894-903.

Tanaka, T.U. Kinetochore–microtubule interactions:steps towards bi-orientation // EMBO J. – 2010. – Vol. 29. – P. 4 070-4082.

Tanaka, T.U., Stark, M.J.R., Tanaka, K. Kinetochore capture and bi-orientation on the mitotic spindle // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2005. – Vol. 6. – P. 929-942.

294

Розділ 8. Різноманітність хромосом

8.1. Еволюція каріотипів

Секвенування геномів багатьох організмів та їх порівняльний аналіз виявив високу консервативність послідовностей ДНК – великі ділянки, довжиною іноді у ціле плече хромосоми, є гомологічними у різних таксонів. Відповідно сучасним уявленням, біологічна еволюція відбувалась не стільки шляхом появи нових нуклеотидних послідовностей, скільки за рахунок "перетасування" вже існуючих. Імовірно, саме унаслідок такого перетасування для різних організмів спостерігається значна різноманітність каріотипів: навіть близькі види часто мають різну кількість хромосом, які відрізняються за своєю морфологією. За останні роки завдяки сучасним молекулярним та цитологічним методам встановлено основні механізми еволюції каріотипів. Шляхи зміни кількості та морфології хромосом подібні у різних таксонів, але наведені у цьому підрозділі приклади стосуються, головним чином, хребетних як однієї з найбільш досліджених у цьому напрямку груп.

8.1.1. Методи аналізу каріотипів. Як зазначалося у розділі

1, аналіз морфології хромосом проводять зазвичай на стадії метафази, коли ступінь компактизації ДНК є максимальним, що дозволяє дискримінувати під оптичним мікроскопом окремі хроматинові структури.

Найбільш простим варіантом фарбування хромосом є метод рутинного забарвлення, коли барвник зв'язується із хромосомою рівномірно по її довжині. Для більш точної ідентифікації хромосом та їх специфічних ділянок застосовують спеціальні методи диференційного забарвлення хромосом, які базуються на використанні певних барвників та процедур попередньої обробки препаратів (рис. 8.1). Найбільш поширеним методом диференційного пофарбування є метод G-забарвлення, який дозволяє отримати хромосоми, нерівномірно пофарбовані по довжині. Малюнок чергування темних (G– позитивних) та світлих (G– негативних) смуг є унікальним для кожної пари

295

гомологічних хромосом. Цікаво, що темні та світлі смуги асоційовані з ділянками, збагаченими на ATта GC-пари відповідно (для останніх характерна підвищена щільність кодуючих послідовностей). Практично таку саму картину чергування смуг дає метод Q-забарвлення (базується на використанні флуоресцентних барвників). Малюнок сегментів при R-забарвленні є протилежним до такого, що спостерігається при G- та Q-забарвленнях: R-позитивні смуги відповідають GCзбагаченим ділянкам геному. Існують також методи диференційного забарвлення, що дозволяють, наприклад, виявляти центромери та перицентромерний гетерохроматин (С- забарвлення) або ядерцеві організатори – місця локалізації кластерів генів рРНК – ( ЯОР-забарвлення).

Довгий час методи диференційного фарбування хромосом (особливо G-метод) були основними при дослідженні та порівнянні морфології хромосом різних видів. Але для чіткого розподілення смуг довжина хромосом повинна бути достатньо великою, а значна кількість видів має дрібні хромосоми – це суттєво обмежувало сферу застосування таких методів. Останнім часом при дослідженні каріотипів використовують метод флуоресцентної гібридизації in situ (FISH, fluorescent in situ hybridization). Метод FISH базується на здатності полінуклеотидних ланцюгів утворювати дуплекси із комплементарними їм ланцюгами. Штучно синтезований зонд, мічений якимось флуорофором, являє собою фрагмент ДНК, комплементарний ділянці хромосоми, яку треба візуалізувати. Такий зонд гібридизується із препаратами хромосом у денатуруючих умовах, і факт гібридизації встановлюють за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Зони хромосом, з якими гібридизувався зонд, випромінюють світло у певному спектральному діапазоні в залежності від властивостей використаної флуоресцентної мітки – світяться відповідним кольором (рис. 8.2).

296

Рис. 8.1. Диференційне забарвлення хромосом людини: Q- забарвлення (а); G-забарвлення (б); R-забарвлення (в); С- забарвлення (г); ЯОР-забарвлення (д), ядерцевий організатор вказано стрілкою.

Отримання міченого зонда

Гібридизація у денатуруючих умовах

Візуалізація

Рис. 8.2. Схема методу FISH.

297

Використання різних комбінацій флуорофорів при міченні зондів та складних систем фільтрів на мікроскопах дозволяє одночасно детектувати велику кількість ділянок на одній хромосомі (метод багатокольорової FISH) на препаратах метафазних пластинок. На відміну від класичних методів диференційного фарбування, методи FISH мають більшу роздільну здатність по відношенню до довжини фрагменту хромосоми, що аналізується (наприклад, проведення специфічної обробки препаратів хромосом перед гібридизацією дозволяє виявляти ділянки довжиною у десятки тисяч пар основ).

Великі блоки хромосом, що виявляються при диференційному забарвленні або при флуоресцентній гібридизації, називаються синтенічними блоками. При порівнянні між різними видами іноді спостерігається однаковий характер розміщення синтенічних блоків на хромосомах. В інших випадках синтенічні блоки можуть входити до складу різних пар гомологічних хромосом та/або змінювати порядок свого розташування. Якщо синтенічні блоки зустрічаються в однаковому порядку у різних видів організмів, це є ознакою спільного предкового каріотипу. Якщо характер їх розташування різний у різних таксонів, це означає більшу еволюційно відстань між такими таксонами. Механізми, що лежать в основі перекомбінації синтенічних блоків і приводять до утворення різних за морфологією хромосом, описуються у наступному підпідрозділі.

8.1.2. Загальні механізми еволюції каріотипів. Нагадаємо ще раз, що загальний опис каріотипу на стадії метафази (у тих організмів, у яких це можливо зробити) базується на визначенні кількості хромосом та їх морфології. При аналізі морфології хромосом визначають їх довжину та центромерний індекс – процентне відношення довжини короткого плеча до цілої хромосоми. На основі останнього хромосоми розділяють на метацентричні (центромерний індекс 50 %), субметацентричні (центромерний індекс менше 50 %) та акроцентричні (центромера майже повністю зміщена до кінця хромосоми і

298

короткі плечі не видно під мікроскопом). Саме за кількістю і співвідношенням в каріотипі трьох типів хромосом принципово розрізняються каріотипи різних видів, і причиною таких відмінностей є численні хромосомні перебудови, що виникають у процесі еволюції. Ці перебудови також призводять і до більш тонких змін у структурі – перекомбінації синтенічних блоків, – які часто не змінюють тип хромосоми і виявляються лише при диференційному забарвленні.

Для того, щоб будь-яка зміна у структурі чи кількості хромосом була зафіксована (збережена) в процесі еволюції, необхідно щоб вона відповідала ряду вимог. По-перше, така зміна повинна виникнути у статевих клітинах. По-друге, вона має стабільно відтворюватися у клітинних поділах. По-третє, її наявність у каріотипі не повинна суттєво впливати на життєздатність організму-носія. На сьогодні описано декілька типів хромосомних перебудов, які відповідають цим вимогам, а отже є причиною утворення нових каріотипів.

Одним із розповсюджених типів перебудов є транслокації – обміни ділянкам між негомологічними хромосомами. Розрізняють реципрокні та нереципрокні транслокації. При реципрокних транслокаціях відбувається взаємний обмін ділянками негомологічних хромосом, а при нереципрокних – ділянка однієї хромосоми приєднується до кінця іншої (за умови порушення її теломерної зони). Обидва типи транслокацій потребують наявності дволанцюгових розривів у молекулах ДНК хромосом, що задіяні в перебудові. Системи репарації упізнають кінці розривів і сполучають фрагменти між собою у декілька різних способів (рис. 8.3).

У випадку сполучення, яке зображене на рис. 8.3 а, кількість хромосом у каріотипі залишається сталою, а поява змін у центромерному індексі залежить від того, чи однаковими за розміром були фрагменти, що перехресно сполучалися. Такий тип транслокацій неодноразово відбувався під час формування каріотипів різних видів. Як приклад на рис. 8.4 наведено схематичне зображення гібридизації зондів, отриманих із хромосом гібона, на хромосомах людини. Можна бачити, що хромосома 16 та довге плече хромосоми 5 людини виникли в

299

результаті реципрокної транслокації двох хромосом деякої предкової форми, що відповідають хромосомам 2 та 18 гібона. Оскільки в процесі еволюції такі транслокації відбувалися неодноразово, і часто в них були задіяні не лише дві хромосоми, то встановити послідовність транслокаційних подій, які привели до появи тієї чи іншої хромосоми, доволі складно.

Центромера

Дволанцюговий розрив

Рис. 8.3. Реципрокні транслокації без утворення дицентричної хромосоми (а), з утворенням дицентричної хромосоми та ацентричного фрагменту (б) та робертсонівська транслокація з утворенням великої метацентричної хромосоми та короткого фрагменту із залишками центромерних ділянок (в).

Іншим наслідком транслокацій є утворення дицентричної хромосоми та ацентричного фрагменту (рис. 8.3, б), що може мати декілька різних наслідків. Найчастіше фрагмент хромосоми, позбавлений центромерної ділянки, буде втрачений при клітинних поділах, а наявність двох центромер у одній хромосомі приводить до аномального розходження хроматид в анафазі. За таких умов хромосомна перебудова не буде спадкуватися і не стане причиною утворення нового каріотипу. Проте, у деяких випадках у межах ацентричного фрагменту може утворюватись неоцентромера (розділ 7), що дасть йому

300

змогу бути приєднаному до веретена поділу, а отже, стабільно передаватися дочірнім клітинам при поділі. Такі фрагменти із неоцентромерами є однією із причин появи у каріотипах так званих додаткових В-хромосом (див. підпідрозд. 8.2.3). З іншого боку, у складі дицентричної хромосоми одна із центромер може підлягати інактивації, що забезпечить нормальну передачу хромосоми при поділі. Прикладом такої інактивації може слугувати поява субметацентричної хромосоми 2 у людини, яка виникла внаслідок транслокації двох акроцентричних хромосом спільного предка людини і шимпанзе (відповідають хромосомам 12 та 13 шимпанзе). В результаті цього кількість хромосом у каріотипі людини (46 у диплоїдному наборі) зменшилася на дві у порівнянні із шимпанзе (48). Слід зазначити, що поява неоцентромери на ацентричному фрагменті та інактивація центромери в дицентричній хромосомі є незалежними подіями і дуже рідко відбуваються одночасно.

Особливим типом реципрокних транслокацій є

робертсонівські транслокації – об'єднання двох акроцентричних хромосом (після розриву у центромерних зонах) у одну метаабо субметацентричну (рис. 8.3, в). Новоутворена об'єднана центромера при цьому зберігає свою функціональність і ефективно формує кінетохор. Іноді й невеликий фрагмент, який містить частину центромерних послідовностей двох хромосом (рис. 8.3, в), також отримує змогу передаватися дочірнім клітинам при поділі. В такому випадку він може слугувати причиною появи у каріотипах В- хромосом (підпідрозд. 8.2.3).

Робертсонівські транслокації є дуже частою подією в еволюції каріотипів – за їх рахунок каріотипи, що мають велику кількість дрібних акроцентричних хромосом, еволюціонують у каріотипи із переважанням великих метата субметацентриків. Наприклад, каріотип домашньої собаки представлений 39 парами хромосом, з яких усі аутосоми (нестатеві хромосоми) є акроцентричними. Каріотип іншого представника, який відноситься до цієї ж родини, – рудої лисиці – характеризується наявністю 16 пар метацентричних або субметацентричних хромосом, частину з яких легко ідентифікувати як результат