Sivolob_A_V__Afanasyeva_K_S_Molekulyarna_organ

281

CenH3-нуклеосоми

Кінетохор

Мікротрубочка

Сестринські Когезини хроматиди

Рис. 7.18. Розтягування центромер сестринських хроматид на стадії метафази створює напругу між хроматидами.

Тут слід ще раз нагадати, що поблизу зовнішнього шару кінетохору в районі фіброзної корони розміщуються білки, які є сенсорами дефектів приєднання та ефекторами контрольної системи. Ці білки присутні у великій кількості лише на

кінетохорах, які не приєднані до мікротрубочок веретена поділу. В момент приєднання їхня концентрація поблизу кінетохорів зменшується у 50-100 разів, що призводить до інактивації системи контролю. Відповідно, монотелічне приєднання (або відсутність приєднання взагалі) зумовлює підвищення концентрації цих білків.

Як більшість біологічних процесів, контроль збірки веретена поділу має каскадний характер: білки-сенсори дефекту безпосередньо чи опосередковано індукують біохімічні модифікації білків-ефекторів, які забезпечують затримку клітини на стадії метафази і блокують сегрегацію хромосом. Численні експерименти вказують на те, що при відсутності приєднання хоча б одного кінетохору до мікротрубочок веретена поділу формується стабільний комплекс із чотирьох білків фіброзної корони – Mad2, BubR1 (Mad3 – у дріжджів), Bub3 та сdc20 – так званий комплекс МСС (mitotic checkpoint complex). Його утворення забезпечує зупинку клітини на стадії

282

метафази шляхом інгібування роботи основного тригера переходу до анафази – убіквітин-лігазного комплексу АРС. Блокування активності АРС зумовлено тим, що його основний кофактор – білок сdc20 – зв'язується компонентами МСС і, тим самим, втрачає можливість забезпечувати впізнання субстратів АРС, основним з яких є інгібітор сепарази – секьюрин.

Яким чином вільний від мікротрубочок кінетохор стимулює утворення комплексу МСС? У відповідь на відсутність зв'язку з мікротрубочками відбувається активація ряду кінетохорних кіназ, зокрема Bub1, Mps1 та BubR1. Це, внаслідок фосфорилювання певних білків кінетохору, призводить до рекрутування на кінетохор білкового гетеродимеру Mad1-Mad2. В інтерфазі комплекс Mad1-Mad2 є структурним компонентом ядерних пор, а після руйнування ядерної оболонки він знаходиться в цитозолі поблизу кінетохорів. Наряду з ним в цитозолі також присутній вільно дифундуючий білок Mad2. Структурний аналіз Mad2 виявив, що білок існує у двох конформаціях: закритій (Mad2С) в складі гетеродимеру та відкритій (Mad2О) у вільному стані. У закритій конформації Mad2С має спорідненість до білка сdc20, але гетеродимери Mad1-Mad2С не можуть створити помітну концентрацію Mad2С поблизу кінетохору, оскільки практично не дисоціюють. Відкрита ж форма Mad2О не має спорідненості до сdc20.

Після приєднання Mad1-Mad2С до кінетохору цей димер ефективно зв'язує вільно дифундуючий Mad2О. Ця взаємодія індукує зміну конформації Mad2О на Mad2С: при цьому дві структурні форми білка розділені високим енергетичним бар'єром – обидві структури (що спостерігається для білків не так часто, але є властивістю, зокрема, пріонів) відповідають глибоким мінімумам вільної енергії. Тобто, закрита конформація Mad2С може існувати достатньо довго: Mad2С дисоціює, його концентрація поблизу кінетохору зростає і утворюється комплекс сdc20-Mad2С (рис.7.19).

cdc2

cdc2

Mad1

Mad2O

Кінетохор

Рис. 7.19. Утворення субкомплекса МСС – димера Mad2С- Cdc20.

Два інших компоненти комплексу МСС – білки BubR1 та Bub3 – знаходяться на кінетохорі, колокалізуючись з кінезинподібним мотором CENP-E. Відсутність зв’язку CENP-E з веретеном поділу стимулює кіназну активність BubR1 (див. вище), що, в свою чергу, через каскад реакцій фосфорилювання компонентів фіброзної корони веде до дисоціації з кінетохору димера Bub3-BubR1 (рис. 7.20). Два утворених субкомплекси сdc20-Mad2С та Bub3-BubR1 об'єднуються в єдиний комплекс МСС, який надійно утримує сdc20 – активність АРС блокується і клітина залишається на стадії метафази.

284

BubR1

CENP E

Bub3 Кінетохорні білки

P P

в

Mad2С-cdc20

MCC

P P

Рис. 7.20. Етапи активації субкомплекса МСС – димера Bub3BubR1. (а, б) – активація білком CENP-E кіназної активності BubR1 та фосфорилювання компонентів кінетохору (Р – фосфатні залишки), (в) – дисоціація Bub3-BubR1 з кінетохору та його об'єднання з Mad2С-сdc20 (рис. 7.19) у комплекс MCC.

Затримка клітини на стадії метафази, зумовлена інгібуванням активності АРС, необхідна для того, щоб дати час виправити дефекти приєднання мікротрубочок до хромосом. Коли амфітелічне приєднання встановлено, необхідно вимкнути систему контролю і дати можливість клітині перейти до анафази. Для цього в першу чергу необхідно припинити утворення комплексів, які здійснюють блокування сегрегації хромосом. В клітині існує декілька механізмів, що відповідають за це.

Першим найбільш важливим механізмом є швидке переміщення, після коректного приєднання мікротрубочок, основних білків-ефекторів та сенсорів системи контролю (білків Mad1, Mad2 та кінетохорних кіназ) від кінетохорів до полюсів клітини. Зменшення концентрації цих елементів системи контролю веде до неможливості утворення комплексу МСС. Рух

285

білків фіброзної корони до полюсів забезпечується мінуснаправленим мотором динеїном. Клітинні лінії, дефектні за цим білком, не здатні до інактивації системи контролю, і всі компоненти фіброзної корони присутні на кінетохорах, які коректно приєднані до мікротрубочок. Активація роботи динеїна співпадає з інактивацією кінетохорних кіназ Bub1 та Mps1, яка відбувається при встановленні контакту з мікротрубочками. Інший додатковий механізм вимикання системи контролю збірки веретена поділу полягає в інактивації кінази BubR1. Оскільки її активність контролюється білком CENP-E, встановлення зв’язку з мікротрубочками призводить до блокування роботи BubR1, димер Bub3-BubR1 не дисоціює з кінетохору і, відповідно, не утворюється комплекс МСС.

Крім зниження ефективності утворення МСС de novo, необхідною умовою інактиваціі системи контролю є також деструкція вже утворених комплексів. Єдиним дослідженим (хоча і не до кінця) механізмом руйнування МСС є активація білка р31comet. Цей білок взаємодіє з димером сdc20-Mad2С в межах комплексу МСС та стимулює убіквітин-лігазну активність сdc20. В результаті автоубіквітинування сdc20 відбувається дисоціація компонентів комплексу МСС (див. рис. 7.20). Крім того, р31comet здатен взаємодіяти з гетеродимером Mad1-Mad2С (див. рис. 7.19) на кінетохорі в такий спосіб, щоб заблокувати сайт взаємодії з Mad2О: в результаті цього ефективність конформаційного перетворення Mad1О в Mad2С суттєво знижується.

Усі процеси, що безпосередньо чи опосередковано забезпечують інактивацію системи контролю збірки веретена поділу запускаються незалежно один від одного. Їх сумісна дія призводить до повного зняття блокади переходу від метафази до анафази і розпочинається процес розходження хромосом.

7.5. Завершення процесу сегрегації хромосом

Як тільки сестринські кінетохори амфітелічно приєднуються до мікротрубочок веретена поділу і активація сепарази приводить до розщеплення когезинів, клітина переходить до

286

анафази. Цю стадію прийнято розділяти на два етапи: анафазу А, під час якої власне відбувається порушення зв’язку між двома хроматидами, і анафазу В, яка характеризується рухом хромосом до полюсів клітини. Коли хромосоми опиняються на полюсах, розпочинається стадія телофази, основним призначенням якої є утворення двох повноцінних ядер, які недовгий час будуть знаходитися в одній цитоплазмі. Наступний за телофазою етап цитокінезу зумовлює розділення клітини на дві дочірні.

Визначальну роль у переході клітини від метафази до анафази, як описано в попередньому підрозділі, відіграє убіквітин-лігазний комплекс АРС, активність якого приводить до деградації двох основних регуляторних білків. В першу чергу убіквітинуванню та деструкції піддаються секьюрини, що зумовлює активацію сепарази та вхід клітини в анафазу А. Майже миттєвий перехід до анафази В реалізується за рахунок руйнування М-циклінів (зокрема, цикліна В1). Їх деструкція приводить до інактивації відповідних циклін-залежних кіназ, що дає змогу фосфатазам дефосфорилювати білки-субстрати цих кіназ. Така хвиля дефосфорилювання через каскадні реакції контролює в клітині процеси, характерні для анафази та телофази.

Рух хромосом в анафазі А та В забезпечується тими ж механізмами, що і конгресія хромосом: з одного боку в ньому приймають участь молекулярні мотори, а з іншого – важливу роль відіграє динамічна нестабільність мікротрубочок. В анафазі А пересування хромосом до полюсів здійснюється за рахунок деполімеризації мікротрубочок на плюс-кінцях. Оскільки білки кінетохору утримують постійний зв’язок з ними, рух хромосом на перших етапах забезпечується просто скороченням мікротрубочок веретена поділу (рис. 7.21).

287

Рис. 7.21. Рух хромосом в анафазі А, зумовлений деполімеризацією кінетохорних мікротрубочок.

Під час анафази В у русі хромосом починають приймати участь також і молекулярні мотори. Плюс-направлені кінезинподібні мотори взаємодіють з міжполюсними мікротрубочками в зоні їх перекриття і, рухаючись по одній мікротрубочці, штовхають іншу – ту, що полімеризується з протилежного полюса, до її мінус-кінця. У результаті збільшується відстань між полюсами (рис.7.22), тобто і між кінетохорними мікротрубочками, а, відповідно, і між двома хромосомами. Не слід забувати, що при цьому відбувається також і деполімеризація плюс-кінця кінетохорних мікротрубочок.

288

Кінезин-подібні мотори

Рис. 7.22. Рух полюсів клітини в анафазі В, зумовлений роботою молекулярних моторів, що працюють на міжполюсних мікротрубочках.

На самому початку руху хромосом, з кінетохорів дисоціюють білки Aurora-B та INCENP (компоненти комплексу СРС) – вони залишаються в екваторіальній площині клітини і не переміщуються разом з хромосомами до полюсів. Їх дисоціація зумовлена дефосфорилюванням INCENP, яке відбувається після інактивації мітотичних циклін-залежних кіназ. Aurora-B та INCENP стабілізують плюс-кінці міжполюсних мікротрубочок в районі їх перекриття, полегшуючи розштовхування полюсів клітини в анафазі В. Крім того, ряд робіт вказує на участь Aurora-B та INCENP у цитокінезі: до них рекрутується група білків, які забезпечують розділення цитоплазми.

Коли хромосоми сягають полюсів клітини, розпочинається утворення ядерної оболонки навколо них, і руйнується веретено поділу. На сьогоднішній день описана група білків, задіяних у декомпактизації хромосом, але детальний механізм цього процесу не встановлений. Відомо, що у більшості організмів

289

деконденсація хроматину спостерігається після утворення ядерної оболонки, формування якої ініціюється взаємодією компонентів ядерної ламіни з поверхнею компактних хромосом.

В ранній телофазі відбувається заміна кофактора убіквітинлігазного комплексу АРС: замість сdc20 з ним починає взаємодіяти білок cdh1 (хоча така заміна відбувається не в усіх організмів). Комплекс АРС-cdh1 забезпечує убіквітинування і подальшу деструкцію білків-стабілізаторів мікротрубочок, кінетохорних кіназ та білків, які забезпечують зв'язок хромосоми з веретеном поділу. В результаті цього хромосоми від’єднуються від мікротрубочок, а веретено поділу деградує.

Утворення ядерної оболонки знаходиться під контролем часового та просторового сигналів. Початок її організації de novo співпадає з інактивацією М-циклінів та їхніх кіназ. В профазі ці CDKs фосфорилюють велику кількість білків – складових ядерних пор, внутрішньої мембрани ядра та ламіни – порушуючи таким чином цілісність ядра. Дефосфорилювання цих білків фосфатазами після інактивації CDKs необхідно для початку утворення оболонки ядра. Власне, часовий контроль збірки ядерної оболонки полягає у тому, що її утворення можливо лише тоді, коли клітина перейде до телофази (саме в цей момент повністю деградують М-цикліни, інактивуються CDKs і розпочинається хвиля дефосфорилювання). Просторовий контроль утворення ядерної оболонки здійснюється за участі GTPази Ran. Як зазначалося вище, цей білок концентрується поблизу хромосом і сприяє росту кінетохорних мікротрубочок в профазі. В телофазі GTPаза Ran рекрутує до хромосом частину складових ядерних пор і мембранні везикули. Таким чином, збірка ядерної оболонки розпочинається на рівні взаємодії індивідуальних хромосом з компонентами ядерного конверта.

Паралельно з утворенням ядер відбувається розподіл цитоплазми. Таким чином в результаті послідовних фаз мітозу утворюються дві дочірні клітини з однаковим набором хромосом, який був характерний для батьківської клітини.

290

Рекомендована література

Загальна

Bloom, K., Joglekar, A. Towards building a chromosome segregation machine // Nature. – 2010. – Vol. 463. – P. 446-456.

Morgan, D.O. The cell cycle. Principles of control – Oxford : Oxford University Press, 2007.

Walczak, C.E., Cai, S., Khodjakov, A. Mechanisms of chromosome behaviour during mitosis // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2010. – Vol. 11. – P. 91-102.

Організація центромери

Carroll, C.W., Straight, A.F. Centromeric chromatin gets loaded // J. Cell Biol. – 2007. – Vol. 176. – P. 735-736.

Centromere. Structure and evolution / eds. Ð. Ugarković. – Berlin, Heidelberg : Springer-Verlag, 2009.

Dalal, Y., Furuyama, T., Vermaak, D., Henikoff, S. Structure, dynamics, and evolution of centromeric nucleosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – Vol. 104. – P. 15974-1598 1.

Ekwall, K. Epigenetic control of centromere behavior // Annu. Rev. Genet. – 2007. – Vol. 41. – P. 63–81.

Furuyama, T., Dalal, Y., Henikoff, S. Chaperone-mediated assembly of centromeric chromatin in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – Vol. 103. – P. 6172–6177.

Hayashi, T., Yohta F., Osamu, I., Yoh A., Kohta T., Mitsuhiro Y.

Mis16 and Mis18 are required for CENP-A loading and histone deacetylation at centromeres // Cell. – 2004. – Vol . 118. – P. 715– 729.

Lamb, J.C., Birchler, J.A. The role of DNA sequence in centromere formation // Genome Biology. – 2003. – V ol. 4. – P. 214218.

Maddox, P.S., Hyndman, F., Monen, J., Oegema, K., Desai, A.

Functional genomics identifies a Myb domain–contain ing protein family required for assembly of CENP-A chromatin // J. Cell Biol. – 2007. – Vol. 176. – P. 757–763.