Sivolob_A_V__Afanasyeva_K_S_Molekulyarna_organ

141

Cremer, T., Cremer, M. Chromosome territories // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. – 2010. – Vol. 2. – a0 03889.

Göndör, A., Ohlsson, R. Chromosome cross-talk in three dimensions // Nature. – 2009. – Vol. 461. – P. 199 -205.

Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R.D. et al. The nuclear lamina comes of age // Nat. Rev. – 2005. – Vol. 6. – Р. 21–31.

Hancock, R. Internal organisation of the nucleus: assembly of compartments by macromolecular crowding and the nuclear matrix model // Biol. Cell. – 2004. – Vol. 96. – P. 595-60 1.

Hetzer, M.W. The nuclear envelope // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. – 2010. – Vol. 2. – a000539.

Hutchison, C.J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2002. – Vol. 3 – P. 848858.

Kumaran, R.I., Thakar, R., Spector, D.L. Chromatin dynamics and gene positioning // Cell. – 2008. – Vol. 132. – P. 929-934.

Lieberman-Aiden, E., van Berkum, N.L., Williams, L. et al.

Comprehensive mapping of long range interactions reveals folding principles of the human genome // Science. – 2009. – Vol. 326. – P. 289-293.

Nickerson, J.A. Experimental observations of a nuclear matrix // J. Cell Sci. – Vol. 114. – P. 463-474.

Pederson, T. Half a century of “the nuclear matrix.” // Mol. Bi ol. Cell. – 2000. – Vol. 11. – P. 799-805.

Rajapakse, I., Groudine, M. On emerging nuclear order // J. Cell Biol. – 2011. – Vol. 192. – P. 711-721.

Soutoglou, E., Misteli, T. Mobility and immobility of chromatin in transcription and genome stability // Curr. Opin. Genet. Dev. – 2007. – Vol. 17. – P. 435-442.

142

Розділ 5. Функціональні процеси в інтерфазному хроматині

Хромосома на стадії інтерфази знаходиться у найважливішому зі своїх станів: саме в інтерфазному хроматині здійснюється первинний етап експресії генетичної інформації – транскрипція і процесинг РНК, а також реплікація ДНК при підготовці до клітинного поділу. Структура та структурна динаміка хроматину – визначальний фактор системи регуляції транскрипції та інших функціональних процесів. У цьому розділі увагу зосереджено на механізмах участі структурних перебудов хроматину в активації та репресії транскрипції. Наприкінці розділу розглядаються механізми реплікації ДНК у хроматині.

5.1. Механізми транскрипції в еукаріотів: загальний огляд

5.1.1. РНК-полімераза та її робочий цикл. В еукаріотичних клітинах функціонують РНК-полімерази трьох типів: РНКполімераза І працює на кластерах генів рибосомної РНК і здійснює синтез рРНК 18S, 28S та 5,8S; РНК-полімераза ІІ, яка виконує основну частину роботи по транскрипції в клітинному ядрі і тому привертає особливу увагу, транскрибує білкові гени, а також гени маленьких ядерних РНК та багатьох інших РНК, що не транслюються; ще одна високоспеціалізована полімераза – РНК-полімераза ІІІ – здійснює синтез тРНК, рибосомної РНК 5S і кількох інших низькомолекулярних РНК.

Кожна з цих полімераз містить чотири гомологічні кó рові субодиниці, які є водночас гомологами чотирьох основних субодиниць бактеріальної РНК-полімерази. Крім того, до складу еукаріотичних полімераз входять п’ять спільних для всіх трьох ферментів субодиниць, а також певний набір специфічних субодиниць (у кількостях 5, 3 і 7 для РНК-полімераз І, ІІ та ІІІ

відповідно).

Отже, РНК-полімераза ІІ, яка відповідає, зокрема, за синтез мРНК, складається з 12 субодиниць (рис. 5.1). У складі

143

найбільшої з них (гомолог субодиниці β'прокаріотичної полімерази) знаходиться каталітичний активний центр, який здійснює приєднання чергового нуклеотида до 3'-кінця транскрипта в кожному елонгаційному циклі полімерази. 5'- Кінець транскрипта виходить за межі полімеразного комплексу через спеціальний канал виходу РНК, через інший – вторинний канал – до активного центру потрапляють рибонуклеозидтрифосфати.

Під час елонгації транскрипції полімераза може зупинятись на певний час – в залежності від перешкод, що створюються хроматиновими білками, особливостей вторинної структури транскрипта, що синтезується (зокрема – утворення дволанцюгових шпильок у його складі), нуклеотидної послідовності тощо. За умови нестабільності РНК-ДНК гібрида в оточенні активного центра (внаслідок приєднання помилкового нуклеотида до 3'-кінця транскрипта) здійснюється зворотний рух полімерази з виходом 3'-кінця РНК у вторинний канал. У цьому випадку взаємодія з фактором транскрипції

TFIIS (Transcription Factor S of RNA-polymerase II) індукує нуклеазну активність РНК-полімерази: здійснюється відщеплення 3'-кінцевого фрагмента РНК та нова спроба синтезу – операція, яка забезпечує редагування помилок при транскрипції.

Особливістю РНК-полімерази ІІ є наявність у найбільшої субодиниці С-кінцевого домену – CTD (C-Terminal Domain). CTD – це довгий невпорядкований хвіст (не показаний на рис. 5.1), амінокислотна послідовність якого є гептапептидом Tyr-Ser-Pro-Thr- Ser-Pro-Ser, що тандемно повторюється 52 рази. Три залишки Ser у складі гептапептиду є субстратами фосфорилювання / дефосфорилювання для специфічних кіназ і фосфатаз. CTD, який відходить від полімерази поблизу від каналу виходу мРНК, є платформою для зв'язування численних білків, спорідненість яких залежить від патерна фосфорилювання. Саме CTD відіграє ключову роль у збиранні елементів системи процесингу мРНК під час елонгації транскрипції.

144

F -спіраль

РНК

Мат ричний

ланцю г

Нем ат ричний

ланцю г

Рис. 5.1. Структура елонгаційного комплексу РНК-полімерази ІІ (код PDB 1R9T). Активний центр знаходиться ліворуч від позначеної на рисунку F-спіралі, полімераза рухається праворуч.

Робочий цикл РНК-полімерази ІІ розпочинається з ініціації транскрипції на промоторі – ділянці, що оточує стартову точку транскрипції. Першою подією ініціації є збирання преініціаторного комплексу за участі РНК-полімерази та шести базальних (загальних) факторів транскрипції (наступний підпідрозділ). Наступна подія – утворення відкритого комплексу – локальне плавлення ДНК за рахунок геліказної активності одного з базальних факторів транскрипції. Матричний ланцюг при цьому занурюється в активний центр, і починається синтез короткого первинного транскрипта. Досить часто при цьому здійснюється абортивна ініціація – дисоціація первинного транскрипта та РНК-полімерази, яка далі може зробити другу спробу ініціації. В іншому випадку реалізується перехід до елонгації транскрипції – РНК-полімераза продовжує синтез РНК після дисоціації більшості базальних факторів від полімерази (очищення промотора).

Ретельні дослідження кінетики роботи РНК-полімерази ІІ на певному гені у живих клітинах дають наступні оцінки проміжків часу, які полімераза проводить у тому чи іншому стані, та ймовірностей переходів від одного стану до іншого

145

(напевно, на різних генах тривалість часових інтервалів та інші параметри можуть варіювати в залежності від ефективності роботи системи регуляції): середній час іммобілізації РНКполімерази на промоторі після зв'язування з ним – 6 с; більшість молекул полімерази після цього просто дисоціюють і лише 13% полімераз переходять до ініціації транскрипції – тоді цей етап продовжується у середньому 54 с; лише 9% таких полімераз вступають до стадії елонгації транскрипції, решта здійснює абортивну ініціацію. Отже, тільки одна молекула полімерази з ~90 таких, що зв'язались із промотором, продукує молекулу мРНК. Така досить низька ефективність може мати біологічне значення, знижуючи ймовірність випадкової транскрипції будьде в геномі ("транскрипційний шум"). Швидкість безупинної елонгації транскрипції становить 30–70 нуклеотидів за секунду. Але частина полімераз зупиняється всередині кодуючої частини гена – тривалість таких пауз може сягати кількох хвилин.

Власне, перша пауза у роботі полімерази відбувається після синтезу перших 20–30 нуклеотидів транскрипта, коли з CTD зв'язується білковий фактор DSIF (DRB-Sensitivity Inducing Factor, DRB – синтетичний інгібітор транскрипції, що спрацьовує тільки за наявності фактора), який рекрутує NELF (Negative ELongation Factor). Цей останній взаємодіє з DSIF,

РНК і РНК-полімеразою, зумовлюючи зупинку руху полімерази. Під час цієї паузи із CTD, РНК і DSIF зв'язуються ферменти, від яких залежить перша подія процесингу мРНК – модифікація її 5'-кінця з утворенням кепа. Після того, як ці ферменти спрацьовують, вони рекрутують P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b), що приводить до втрати спорідненості DSIF і, відповідно, дисоціації NELF. У результаті РНК-полімераза продовжує свій рух.

Пауза в роботі РНК-полімерази відразу за стартом транскрипції є важливим моментом регуляції експресії гена. У генах, які потребують швидкої активації у відповідь на зовнішні сигнали (наприклад, гени теплового шоку), РНК-полімераза є "заарештованою" в цій позиції і продовжує рух тільки після індукованих зовнішніми сигналами (для генів теплового шоку – підвищенням температури) додаткових впливів. Отже,

146

зв'язування P-TEFb, який знімає блокаду РНК-полімерази, залежить від присутності певних транскрипційних факторів та змін у характері модифікацій гістонів у складі найближчої нуклеосоми (мова йде про позиційовану нуклеосому +1, яка згадувалась у попередньому розділі, – саме вона знаходиться відразу за стартовою точкою транскрипції).

Процес синтезу мРНК супроводжується її сплайсингом: на інтронах у складі пре-мРНК і CTD збираються сплайсосоми, де здійснюється вирізання інтронів та зшивання екзонів. Закінчується робочий цикл РНК-полімерази ІІ у той момент, коли у складі пре-мРНК з'являється специфічна послідовність – сигнал термінації – polyA-сигнал. На цій послідовності відбувається збірка мультибілкового комплексу, в складі якого здійснюється розрізання транскрипта і поліаденилування 3'- кінця, що утворився, – події, що супроводжують термінацію транскрипції зі звільненням зрілої мРНК та дисоціацією полімеразного комплексу від ДНК.

5.1.2. Базальні фактори транскрипції. Для ініціації транскрипції є необхідним збирання на промоторі преініціаторного комплексу (PIC – P re-Initiation Complex) за участю 12-субодиничної РНК-полімерази ІІ та принаймні шести базальних факторів транскрипції TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Послідовність збирання преініціаторного комплексу може бути різною, але всі базальні фактори мають бути присутніми у складі РІС для подальшого запуску транскрипції.

TFIID – один із найважливіших базальних факторів, який визначає впізнання стандартних елементів промотора (якщо вони присутні, див. наступний підпідрозділ). Основою структури TFIID є ТВР (TATA-box Binding Protein) – білок зі специфічною спорідненістю до одного з таких стандартних елементів – ТАТА-бокса. Досить широкий β-шар у складі ТВР взаємодіє з маленьким жолобком ДНК, наслідком чого є суттєва деформація подвійної спіралі з її розкручуванням та значним вигином у протилежний від білка бік (рис. 5.2). Саме з цього протилежного боку (усередині вигину) розташовуються інші

147

білкові компоненти преініціаторного комплексу, які обгортаються промотором. Отже, вигин ДНК, який індукується ТВР (незалежно від того, чи є присутнім у промоторі ТАТАбокс) організує промотор і зв'язані з ним елементи в єдиний компактний комплекс і підтримує його стабільність. Досить часто (але не обов'язково) зв'язування TFIID ініціює збирання РІС.

Із ТВР у складі TFIID зв'язані так звані ТВР-асоційовані фактори (TAFs – T BP Associated Factors) – вісім або більше білків (конкретний склад факторів варіює для різних промоторів). TAFs взаємодіють з ТВР і між собою, деякі з них здатні також взаємодіяти з ДНК та гістонами. Зокрема, білок TAFІІ250 (250 – молекулярна вага в кілодальтонах) є практично обов'язковим компонентом TFIID (як і ТВР), виконуючи роль основного фактора збирання, з яким взаємодіють інші TAFs. Крім того, TAFІІ250 містить у своєму складі бромодомен і гістонацетилтрансферазну активність: відповідно, здатен як впізнавати ацетильовані гістони в зоні промоторів, так і здійснювати їхнє ацетилювання.

TBP

TFIIB

Рис. 5.2. Комплекс із ДНК ДНК-зв'язувального домену ТВР і С- кінцевої частини TFIIB у двох проекціях (код PDB 1D3U).

TFIIA – гетеродимерний білок, кофактор, що стабілізує комплекс ТВР з ДНК. Відповідно, цей фактор можна було б вважати ще одним TAF.

148

TFIIB – мономерний білок із мультидоменною структурою. Два С-кінцевих домени взаємодіють із ДНК по обидва боки від сайта зв'язування ТВР, із внутрішнього боку вигину, який індукується цим білком (рис. 5.2). Таким чином, два білки, які взаємодіють також між собою, зв'язуються з ДНК кооперативно, взаємно підсилюючи спорідненість до неї.

Два С-кінцеві домени TFIIB мають різну структуру і взаємодіють з різними елементами ДНК (маленьким та великим жолобками). Така асиметрія (існування двох альтернативних варіантів зв'язування з ДНК) відіграє роль у визначенні напрямку транскрипції. Це пов’язано з тим, що N-кінцева частина TFIIB (практично не має регулярної вторинної структури) взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ. Таким чином, саме TFIIB визначає положення полімерази на ДНК відносно стартової точки в одній із двох можливих орієнтацій ферменту.

Витягнута N-кінцева частина TFIIB взаємодіє з РНКполімеразою в зоні активного центру, після початку транскрипції здійснює взаємодії з РНК-ДНК гібридом, а також блокує канал виходу РНК. Відповідно, TFIIB має бути звільненим при переході від ініціації до елонгації транскрипції (при очищенні промотора).

TFIIF – гетеродимер, взаємодіє з РНК-полімеразою ІІ (у зоні активного центру), з ДНК, з базальними факторами TFIIЕ та TFIIН. Після первинного плавлення ДНК при ініціації транскрипції TFIIF здійснює взаємодії з нематричним ланцюгом, стимулює роботу TFIIН (див. нижче), запобігає абортивній ініціації. Після завершення ініціації TFIIF разом з іншими базальними факторами дисоціює від РНК-полімерази, але може реасоціювати з нею під час елонгації – у випадку зупинки ферменту. Його роль як фактора елонгації транскрипції полягає у стимуляції продовження руху полімерази.

TFIIЕ – гетеродимер, стимулює роботу TFIIН, взаємодіє з транскрипційним міхуром при ініціації транскрипції.

TFIIН – найбільший із базальних факторів, складається з 10 субодиниць, має молекулярну вагу, порівняну з такою РНКполімерази. TFIIН – єдиний базальний фактор, що має

149

ферментативні активності. Перша з них – АТР-залежна ДНК-геліказна (гелікази – helicases – ферменти, що розкручують подвійну спіраль). Саме за рахунок цієї активності відбувається первинне локальне плавлення подвійної спіралі ДНК в зоні активного центру при ініціації транскрипції (утворення відкритого комплексу). Друга ферментативна активність TFIIН – кіназна, за рахунок якої здійснюється фосфорилювання С-кінцевого домену РНК-полімерази при переході від ініціації до елонгації транскрипції. У дефосфорильованій формі, на стадії збирання преініціаторного комплексу, CTD взаємодіє з базальними факторами транскрипції; після фосфорилювання певних залишків Ser ця взаємодія порушується, і виникає спорідненість до згаданих у попередньому підпідрозділі факторів, від яких залежить утворення кепа на 5'-кінці мРНК.

Ефективне збирання преініціаторного комплексу є можливою лише за участі ще одного структурного модуля – медіатору (mediator), який містить понад 20 субодиниць (склад варіює для різних промоторів – певний мінімальний набір субодиниць доповнюється більш специфічними за рахунок взаємодії з транскрипційними факторами). Цей мультибілковий комплекс має витягнуту структуру, яку можна розділити на три частини:

голова (h, head), середня частина (m, middle) і хвіст (t, tail).

Медіатор здійснює лише білок-білкові взаємодії: голова й середня частина взаємодіють з РНК-полімеразою, середня частина та хвіст – зі специфічними факторами транскрипції, що зв'язані на регуляторних елементах послідовності (цис-елементах, підпідрозд. 5.1.6). Таким чином, медіатор є засобом передачі “ активаційних сигналів” з цис-елементів на РНК-полімеразу: збільшення кількості взаємодій підсилює ефективність збирання преініціаторного комплексу.

5.1.3. Структурна організація транскрипційної системи у клітинному ядрі. У принципі є можливими два варіанти взаємного переміщення РНК-полімеразного комплексу і ДНК під час транскрипції: або полімераза рухається вздовж ДНК (як потяг по рейках), або ДНК протягується через іммобілізовану

150

РНК-полімеразу. Напевно, реалізуються обидві можливості, але останнім часом накопичується все більше свідчень на користь того, що значна частина транскрипційних подій відбувається у так званих транскрипційних фабриках – великих мультимолекулярних комплексах, які містять віддалені по ланцюгу регуляторні елементи ДНК, зв'язані з ними білки та іммобілізовані молекули РНК-полімерази (рис. 5.3).

Транскрипт

РНК-полімераза

Промотор

Хроматинова

фібрила

Рис. 5.3. Транскрипційна фабрика.

У різних клітинах знаходиться від кількох сотень до кількох тисяч таких фабрик (структурна основа фабрики залишається незрозумілою), на яких об'єднується від двох до кількох десятків транскрипційних одиниць (одна така спеціалізована фабрика – ядерце, де здійснюється синтез рибосомної РНК РНКполімеразою І на об'єднаних в єдину структуру ядерцевих організаторах різних хромосом – є давно і добре відомою). Різноманітні елементи системи активації транскрипції можуть бути об'єднані в межах транскрипційної фабрики і спільно використовуватись кількома промоторами, які зв'язуються з фабрикою при ініціації транскрипції. При цьому певні елементи системи регуляції транскрипції (включаючи і саму РНКполімеразу) можуть зв'язуватись з промоторами заздалегідь, переводячи їх у стан потенційної здатності взаємодії з транскрипційною фабрикою. Така фабрика може слугувати місцем для узгодженої транскрипції групи генів, що