Процедура визначення наявності IgМ до вірусу кору методом іфа

Стадія 1 Внести в лунки:	Лунка (об’єм рідини в мкл)
	А1 бланк	В1/С1 Негат. контроль NC	D1/E1 Позит.контроль РС	F1… Зразок
NC у дві лунки РС у дві лунки Розведені зразки	- - -	100 - -	- 100 -	- - 100
Закрити стрипи MIC плівкою
Інкубувати 30 хв при 17-250С
Промити лунки 4 рази
Робочий розчин промивного буферу WS	350	350	350	350
Стадія 2 Внести в лунки:
Кон’югат анти-IgM CON	-	100	100	100
Закрити стрипи MIC плівкою
Інкубувати 30 хв при 17-250С
Промити лунки 4 рази
Робочий розчин промивного буферу WS	350	350	350	350
Стадія 3 Внести в лунки:
Cубстратний реагент SUB	100	100	100	100
Інкубувати 15 хв при 17-250С
Добавити стоп-реагент STOP	100	100	100	100
Перемішати
Обнулити планшетний фотометр по лунці А1 з бланком.
Після додавання стоп-реагента якомога скоріше (не більше, ніж через 30 хв) виміряти оптичну щільність при довжині хвилі 450 нм, використовуючи референтну довжину хвилі 630-690 нм.

Отриманий результат оцінювали так: R<0,8 – негативний результат; R від 0,8 до 1,1 – граничний результат; R>1,1 – позитивний результат.

У випадку граничного результату необхідно взяти у пацієнта додатковий зразок крові через 7 діб [15].

3.3 Виявлення IgM до вірусу червонянки за методом ІФА

1. Принцип методу. У лабораторній діагностиці червонянки найширше використовуються серологічні методи. Імунологічним маркером первинної інфекції є IgM до вірусу червонянки, що з'являються в перші дні захворювання. Максимальний рівень IgM-антитіл відзначається на 2-3 тижні і знижується через 1-2 місяці. IgM специфічні до вірусу червонянки антитіла виявляються також при вакцинації пацієнта [10].

При внесенні в лунки досліджуваної сироватки усі антитіла класу IgМ, присутні в зразку, зв'язувалися з моноклональними антитілами на твердій фазі, утворюючи комплекси. На наступному етапі IgM, специфічні саме до вірусу червонянки, виявляли за допомогою антигенів вірусу червонянки у складі пероксидазного кон’югата. Після відмивання незв'язаних компонентів в лунки додавали субстратний буфер (перекис водню) і розчин ТМБ. Пероксидазну реакцію зупиняли, додаючи стоп-реагент, і виміряли оптичну щільність суміші в лунках при довжині хвилі 450/620 нм, яка пропорційна концентрації специфічних IgM антитіл до вірусу червонянки в зразках сироваток або плазми крові.

2. Матеріали і реагенти.

Набір містив наступні реагенти: імуносорбент, кон’югат, К- – негативний контроль, К+ – позитивний контроль, КРП, РРС, Розчин ТМБ, СБР, РРК, Стоп-реагент. Досліджувані зразки сироваток, негативні і позитивні контрольні сироватки розводили в співвідношенні 1:51 розчином для розведення сироваток, до 0,5 мл (500 мкл) РРС додавали 0,01 мл (10 мкл) сироватки або контрольної сироватки.

3. Устаткування та обладнання: пробірки для аналізу, трансфер-піпетки, вортекс, мікропіпетки об'ємом 50-100 мкл і на 1 мл, мірні циліндри (10, 50, 1000 мл), таймер, прилад для промивання планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл), планшетний фотометр (450 нм, при необхідності додаткова довжина хвилі порівняння ≥ 600 нм), фільтрувальний папір, контейнер для відходів, термостат на 37⁰С.

4. Процедура дослідження

Вносили заздалегідь розведені сироватки – у лунку А1 - 0,100 мл (До+); у лунки В1 і С1 – по 0,100 мл (До-); у інші лунки – по 0,100 мл (100 мкл) досліджуваних сироваток. Накривали планшет плівкою або кришкою і інкубували при температурі 37ºС впродовж 30 хвилин. Видаляли вміст з усіх лунок за допомогою промивача або 8-ми канальної піпетки, потім усі лунки промивали чотири рази розчином для промивання планшета і видаляли залишки вологи. В усі лунки планшета вносили по 0,1 мл (100 мкл) розчину кон’югата. Планшет інкубували при кімнатній температурі впродовж 30 хв. Видаляли вміст з усіх лунок за допомогою промивача або 8-ми канальної піпетки, потім усі лунки промивали 6 разів розчином для промивання планшета і видаляли залишки вологи. Готувати ТМБ-субстратний розчин. Вносили в лунки планшета по 0,100 мл (100 мкл) розчину ТМБ-субстрату. Планшет інкубували при кімнатній температурі в захищеному від світла місці впродовж 30 хв. Зупиняли реакцію шляхом внесення в усі лунки планшета по 0,1 мл (100 мкл) стоп-реагента. Не пізніше ніж через 5 хв після зупинки реакції, визначали ОЩ в лунках в двоххвилевому режимі: при довжині хвилі 450 нм відносно 620 нм.

5. Оцінка отриманих результатів і їх інтерпретація

Результати враховували тільки при дотриманні наступних умов: ОЩср (До-) не повинна була перевищувати 0,2; якщо одне з двох значень ОЩ (До-) більше 0,2 його відкидали. При дотриманні перелічених вище умов розраховували межове значення ОЩ (ГЗ) за формулою ГЗ = ОПср + 0,2, де 0,2 – константна величина. Визначали "сіру зону". "Сіра зона" – зона значень ОЩ, від ГЗ до значень ОЩ, менших ГЗ на 10%. Результат аналізу вважали негативним, якщо значення ОЩ досліджуваного зразка було меншим за нижній рівень ОЩ “сірої зони". Результат аналізу вважали позитивним, якщо значення ОЩ досліджуваного зразка було більшим за ГЗ. Зразки зі значенням ОЩ в межах "сірої зони" вважали невизначеними. У цьому випадку тест повторювали в двох лунках. Якщо результат знову був невизначеним, повторювали дослідження сироватки крові хворого через 10-14 днів. Якщо при повторному тестуванні результат знову був в цьому інтервалі значень, його вважали негативним [10].

4. Метод визначення IgM до оболонкового протеїну gp 125 вірусу Епштейна-Бар

1. Матеріали і реагенти.

Набір містив наступні реагенти: негативний контроль – містив бичачий сироватковий альбумін, фенол, проклін 300 і гентаміцину сульфат; позитивний контроль – містив бичачий сироватковий альбумін, фенол, проклін 300 і гентаміцину сульфат; концентрат миючого буфера – РВS/Твін (10Х), рН 7.2-7.4, містив проклін 300; буфер для розведення проб – забарвлений в зелений колір, містив бичачий сироватковий альбумін, фенол, проклін 300 і гентаміцину сульфат, рH 7.2- 7.4; Antigen – Dil – ацетат натрію/оцтова кислота, містив проклін 300; Antigen – EBV VCA gp 125 antigen/BSA/FCS; кон’югат – анти- VCA gp 125 IgG антитіла, моноклональні (мишачі), кон’юнгований HRP – забарвлений в червоний колір, містив бичачий сироватковий альбумін, фенол, проклін 300 і гентаміцину сульфат; ТМВ-субстрат; стоп - розчин – 0,5 М р-н сірчаної кислоти [8].

2. Устаткування та обладнання: мікропланшета – 12 стрипів по 8 лунок, вкриті козим анти-людським IgM імуноглобуліном, містила бичачий сироватковий альбумін і pH індикатор; вода для ін'єкцій; мікропіпетки зі змінним об'ємом; прилад для промивання планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл), планшетний фотометр (450 нм, при необхідності додаткова довжина хвилі порівняння ≥ 600 нм), фільтрувальний папір, контейнер для відходів, термостат на 37⁰С.

3. Процедура дослідження.

У якості досліджуваного матеріалу брали сироватку крові, розведену 1:100 буфером для розведення проб.

Лунку А1 залишали порожньою в якості бланка. У відповідні лунки планшета додавали по 50 мкл негативного контролю, позитивного контролю і розведеної сироватки пацієнтів. Стрипи інкубували впродовж 60 хв (± 5 хв) при температурі 37°С у вологій камері. Готували суміш антиген-кон’югат. Після інкубації стрипи промивали три рази по 200 мкл промивного буфера на кожну лунку. Додавали суміш антиген-кон’югат (червоного кольору) в кожну лунку (виключаючи А1). Інкубували впродовж 60 хв.при температурі 37° С у вологій камері або заклеєними в інкубаційну обгорткову фольгу. Після інкубації промивали стрипи ще раз. Додавали в усі лунки 50 мкл ТМВ-субстрату і інкубували протягом 30 хв при температурі 37°С в вологій камері. Позитивні проби набували блакитного кольору. Додавали 100 мкл стоп-розчину в кожну лунку для зупинки реакції. У позитивних сироватках відбувалася зміна забарвлення з блакитного на жовтий.

4.Оцінка отриманих результатів і їх інтерпретація. Зчитування значень оптичної щільності (ОЩ) здійснювали при довжині хвилі 450 нм (референс 620 - 650 нм). Віднімали значення ОЩ бланка (лунка А1) з усіх інших значень ОЩ. Номінальне значення негативного контролю < 0,150. Номінальне значення позитивного контролю > 0,800. Cut-off = номінальне значення ОЩ негативного + 0.140. Проби, значення ОЩ яких лежали нижче нижньої межі «сірої зони», оцінювалися як негативні. Проби, значення ОЩ яких лежали в межах «сірої зони», оцінювалися як невизначені. Вони були повторно протестовані паралельно зі свіжими зразками, узятими через 14 днів, щоб визначити зміну титру. Проби, значення ОЩ яких лежали вище за верхню межу «сірої зони», оцінювалися як позитивні [8].