3.Особливості перебігу ротавірусної інфекції у дітей

Ротавіруси людини уперше виявили в 1973 р. Р. Бішоп із співавторами при електронно-мікроскопічному дослідженні ентероцитів дванадцятипалої кишки у хворих на гастроентерит дітей і в їх випорожнюваннях за допомогою методу імунної електронної мікроскопії, а у дослідах на добровольцях було доказано їх етіологічну роль [21].

У 1978 р. Міжнародний комітет з таксономії вірусів виділив ротавіруси в самостійний рід Rotavirus родини Reoviridae. Віріон має сферичну форму, а його геном оточений нуклеокапсидом, що складається з двох шарів: внутрішній шар щільно оточує серцевину, має форму ікосаедра і стикається з тонким зовнішнім шаром капсиду, в результаті утворюється структура, що нагадує колесо: втулка, спиці і обідок. У виділеннях хворого зазвичай зустрічаються однокапсидні (60-65 нм) і двохкапсидні віріони (70-75 нм). Інфекційними є повні двухкапсидні віріони.

Геном віріона представлений дволанцюговою фрагментованою РНК (11 фрагментів); у серцевині окрім геномної РНК розташовується віріонна РНК-полімераза. Суперкапсид відсутній. У складі віріона є 8 білків (VP1–VP8). Особливо важливим є VРЗ-білок зовнішнього капсиду. Він відповідає за проникнення вірусу в клітину і його вірулентність. Крім того, він має гемаглютинуючу властивість. По білках VP3 і VP7 ротавіруси ділять на 4 сероваріанти. Ротавіруси людини і тварин по групових антигенах підрозділяються на 6 серогруп: А, В, С, D, Е, F. Їх представники не мають антигенної спорідненості і різняться за електрофоретичними властивостями геномної РНК [30].

Ротавіруси реплікуються головним чином в кишечнику і заражають ентероцити ворсинок тонкого кишечника, що призводить до структурних і функціональних змін епітелію. Потрійна білкова оболонка робить їх стійкими до кислого середовища шлунку і травних ферментів в кишечнику. Вірус проникає до клітини шляхом опосередкованого рецепторами ендоцитоза і утворює ендосоми. Білки в третьому шарі (VP7 і шпилька VP4) порушують мембрану ендосоми, створивши різницю в концентрації кальцію. Це викликає розпад VP7-тримерів на поодинокі білкові субодиниці, білки VP2 і VP6, що при цьому залишилися, утворюють двошарову частку (DLP) навколо вірусної двониткової РНК. Одинадцять дволанцюгових РНК залишаються під захистом двох білкових оболонок, де вірусна РНК-залежна РНК-полімераза створює транскрипти мРНК вірусного генома. Залишаючись в ядрі віріона, вірусна РНК уникає імунної відповіді, що називається РНК-інтерференцією.

Під час інфекції ротавірус синтезує мРНК для біосинтезу білку і реплікації генів. Більшість ротавірусних білків накопичуються у віроплазмі, де реплікується РНК і збираються DLP. Віроплазми формуються навколо ядра клітини вже через дві години після початку вірусної інфекції і складаються з вірусних фабрик, що створюються, як передбачається, двома вірусними неструктурними білками: NSP5 і NSP2. DLP мігрують в ендоплазматичний ретикулум, де вони отримують свій третій, зовнішній, шар (створений VP7 і VP4). Потомство вірусу вивільняється з клітини шляхом лізису [30].

Джерело зараження при ротавірусній інфекції – людина. Хворіють головним чином діти у віці до 4 років. Ротавіруси щорічно викликають більше 130 млн випадків захворювання на діарею, в результаті чого щорічно помирає до 600 тис. осіб.

Ротавіруси розмножується в епітеліальних клітинах дванадцятипалої кишки, викликаючи різні ушкодження. Інкубаційний період варіює від 1 до 7 днів, але зазвичай менш 2-х діб. При типовій ротавірусній інфекції основним раннім симптомом є блювота, яка виникає раніше, ніж діарея, і триває від 2 до 6 днів. Відзначається невелике підвищення температури. Діарея проявляється у вигляді частих позивів, стілець рідкий або напіврідкий, частота позивів до 20 раз на день. Дегідратація спостерігається у 83 % хворих. Тривалість хвороби варіює від 4 до 7 днів, виділення вірусу триває до 10 днів. Блювота досягає максимуму в перші 2 дні хвороби, пронос триває довше [31].

Основними методами діагностики ротавірусних діарей є: 1) виявлення вірусу в фекаліях за допомогою електронної і імунної електронної мікроскопії, імуноферментного аналізу в твердофазному варіанті, РЗК, реакції коаглютинації, клонованих РНК-зондів; 2) специфічні антитіла виявляють за допомогою різних серологічних реакцій, у тому числі за допомогою імуноферментного методу, РЗК, реакції нейтралізації і імунофлуоресценції.

Лікування ротавірусної діареї переслідує дві головних мети: припинення дегідратації і відновлення і підтримка нормального водно-сольового обміну. Ротавірусна діарея успішно виліковується шляхом регідратації за допомогою орального сольового розчину. У США створена високоефективна вакцина проти ротавірусної інфекції [17, 30].

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

3. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дипломну роботу спеціаліста було виконано на базі баклабораторії КЗ Дніпродзержинської міської лікарні №7. Об’єктом дослідження була частота виділення вірусів – збудників інфекційних хвороб у дітей в м. Дніпродзержинську.

3.1 Метод ІФА для виявлення антигену ротавірусу у зразках фекалій

Наявність Аг ротавірусу у зразках фекалій визначали за допомогою імуноферментного тесту RIDASCREEN [9].

1. Принцип методу. В імуноферментному тесті RIDASCREEN для визначення ротавірусного Аг використовували принцип сендвіч-методу. На поверхню лунок мікропланшетів сорбували моноклональні антитіла до капсидного білку-продукту шостого вірусного гена ротавирусів, який є групоспецифічним антигеном для усіх відомих патогенних для людини ротавірусів. У лунку вносили аліквоту тестованої суспензії калу і інкубували одночасно з іншими моноклональними антитілами до ротавірусу, кон’югованими з пероксидазою хріну. В результаті інкубації утворювався сендвіч-комплекс, в якому антигени ротавірусу знаходилися між твердою фазою лунок і антитілами, кон’югованими з ферментом. Антитіла, що не зв'язалися з ферментом надалі видаляли промиванням. У лунки вносили субстрат. Якщо тест виявлявся позитивним, фермент, що зв'язався з лунками, перетворював безбарвний субстрат на забарвлений в синій колір продукт. Додавання стоп-реагента змінювало забарвлення з синього кольору на жовтий. Інтенсивність забарвлення була прямо пропорційною кількості антигена ротавірусу, присутнього в зразку [9].

2. Матеріали і реагенти.

Набір містив наступні реагенти: 1) Plate – мікропланшет в рамці-утримувачі, що складався з дванадцяти відокремлюваних 8-лункових стрипів, з адсорбованими мишачими моноклональними антитілами до ротавірусу. 2) Diluent 1 – буфер для розведення зразків, готовий до використання і який містив білковий забуферний розчин NaCl і 0,1% Kathon. Забарвлений у блакитний колір. 3) Wash – промивальний буфер – 10-кратний концентрат, який містив фосфатний буфер, NaCl і 0,1% мертіолат. 4) Сontrol+ – позитивний контроль, що містив інактивований ротавірус мавп (SA - 11). Готовий до використання. 5) Conjugate – кон’югат ферменту. Містив моноклональні антитіла до ротавірусу, кон’юговані з пероксидазою хріну, в стабілізуючому білковому розчині. Готовий до використання. Містив 0,1% Kathon. Забарвлений в зелений колір. 6) Substrate – розчин субстрату, який містив перекис сечовини і тетраметилбензидин (ТМБ). Готовий до використання. 7) Stop – стоп-реагент – містив 1н сірчану кислоту.

3. Устаткування та обладнання: пробірки для аналізу, трансфер-піпетки, вортекс, мікропіпетки об'ємом 50-100 мкл і на 1 мл, мірний циліндр (1000 мл), таймер, прилад для промивання планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл), планшетний фотометр (450 нм, при необхідності додаткова довжина хвилі порівняння ≥ 600 нм), фільтрувальний папір, контейнер для відходів.

4. Процедура дослідження

Перед використанням прогрівали усі реагенти і планшет Plate при кімнатній температурі (20-25°С). Безпосередньо перед використанням усі реагенти ретельно перемішали. Для приготування промивального буфера одну частину концентрованого промивального буфера Wash розводили дев'ятьма частинами дистильованої води. Для приготування зразків поміщали 1 мл буфера для розведення зразків Diluent 1 в промарковану пробірку. Набирали в одноразову піпетку рідкі фекалії до тих пір, поки рівень рідини не піднімався вище другого потовщення (приблизно 100 мкл), і суспендували його у буфері для розведення зразків, поміщеному в пробірку. Надалі зразок центрифугували при 5000 об/хв (приблизно 2300-2500 g) впродовж 5 хвилин. Поміщали в утримувач необхідну кількість лунок. Вносили в лунки по 2 краплі (100 мкл) позитивного контролю Control+, буфера для розведення зразків Diluent 1 (негативний контроль) чи розведених зразків. Додавали в кожну лунку по 2 краплі антитіл, кон’югованих з ферментом Conjugate. Ретельно перемішували і інкубували при кімнатній температурі протягом 60 хвилин.

Надалі до кожної лунки додавали по 2 краплі субстрату Substrate. Інкубували планшет 15 хв при кімнатній температурі в темному місці. Після інкубації реакцію зупиняли додаванням в кожну лунку по 1 краплі стоп-реагента Stop. Після акуратного перемішування вимірювали поглинання при 450 нм, використовуючи довжину хвилі порівняння ≥ 600 нм.

5. Оцінка отриманих результатів і їх інтерпретація

1. Розрахунок порогового рівня (рівня відсікання, cut - off). Рівень відсікання визначали додаванням 0,15 одиниць оптичної щільності до виміряного значення негативного контролю.

Рівень відсікання = оптична щільність негативного контролю + 0,15

2. Результати тесту. Зразки вважали позитивними, якщо оптична щільність більш ніж на 10% перевищувала рівень відсікання. Зразки, оптична щільність яких лежала в межах ±10% від рівня відсікання не могли бути достовірно віднесені до позитивних або негативних. Їх розглядали, як невизначені (чи сумнівні). У таких випадках повторювали дослідження з новим зразком. Якщо результат повторного дослідження знову виявлявся невизначеним, зразок розглядали, як негативний. Зразки вважали негативними, якщо їх оптична щільність була нижчою, ніж на 10% за рівень відсікання [9].

2. Визначення IgМ до вірусу кору у сироватці крові за методом ІФА

1. Принцип методу. Визначення IgM до вірусу кору здійснювали класичним методом двухстадійного непрямого імуноферментного аналізу. Лунки мікропланшету, що є твердою фазою, були вкриті антигенами вірусу кору (ВК АГ), отриманими з клітинної культури, ураженою вірусом кору. На першій стадії інкубації антитіла до ВК, що містилися у контролях і дослідних зразках, зв’язувалися із імобілізованими антигенами (ВК АГ). Після промивання, при якому видалялися незв’язані компоненти сироваток, у лунки додавали кон’югат, що представляв собою антитіла до IgM людини, мічені пероксидазою хріна (HRP). У результаті інкубації (стадія 2) кон’югат специфічно зв’язувався на поверхні лунок з антитілами класу IgM, утворюючи типоспецифічні імунокомплекси. Після повторної промивки, при якій видалявся незв’язаний кон’югат, в лунки вносили субстрат (стадія 3). Ферментативна реакція пероксидази із субстратом ТМБ приводила до утворення забарвленого продукта, що змінював колір з синього на жовтий після додавання стоп-реагента. Інтенсивність забарвлення була прямо пропорційна концентрації анти-ВК IgM антитіл у зразку і вимірювалася на мікропланшетному фотометрі із довжиною хвилі 450 нм. Результат інтерпретували, як позитивний чи негативний при порівнянні з розрахованим значенням рівня відсікання (cut-off) [15].

2. Матеріали і реагенти. До складу набора входили: лунки мікропланшета, вкриті антигенами: 12 стрипів 8-лунковиху рамці-тримачі (MIC); кір IgМ позитивний контроль (на основі сироватки людини) (PC); кір IgМ негативний контроль (на основі сироватки людини) (NC); ферментний кон’югант – антитіла кроля до IgМ людини, кон’югованих з пероксидазою хріна (CON); IgМ буфер для розведення зразків – 0,01М фосфатний буфер, який містив 8 г/л хлориду натрію; 10 г/л альбуміну і антитіла кози до IgG, рН 6,5 (DIL-M); промивний буфер – концентрат (на 1000 мл готового розчину, що містив 10 ммоль/л трис-сольового буферу і 8 г/л хлориду натрію, рН 7,2) (WS); субстратний реагент – розчин хромогену/субстрату – ТМБ/Н₂О₂ (1,2 ммоль/л 3,5-триметилбензидина і 3 ммоль/л перекису водню, рН 3,7) (SUB); стоп-реагент – 0,5 М сірчаної кислоти (STOP).

3. Підготовка зразків: зразки пацієнтів розводили 1:101 буфером для зразків.

4. Процедура дослідження. Перед використанням всі реагенти повинні бути кімнатної температури. Надалі змішували реагенти згідно схеми (табл. 3.1).

Таблиця 3.1