Глава 1

ПРОБЛЕМА СТРУКТУРИРОВАННОГО СОСТОЯНИЯ ВОДЫ

(обзор литературных данных)

1-1.Современные представления о структуре воды.

Необычные свойства воды, обнаруживаемые в физико­химических экспериментах, и ее роль в биологических системах объясняют повышенный интерес к изучению структуры воды. Наи­более полно эти два фактора отражены в последних академических монографиях, охвативших полный перечень отечественных и ино­странных работ по исследованию воды[1,2,6]. Попытки привлечь внимание к проблеме структуры воды были осуществлены так­же в некоторых других изданиях и статьях [7,12,13,19,21,57,63,66,67,71,73,75,76,138].

Несмотря ка многочисленные исследования водной среды, в результате которых были детально проанализированы как обычные так и аномальные свойства воды, основным критерием структурно-

i-oподхода оставались данные о геометрии самой молекулы воды. Наиболее важным для построения структурных моделей водных ассоциатов оказалось то обстоятельство, что уголмеждуОН- связями в Н₂0,равный 104,45°, не сильно отличается от тетраэдри­ческого угла в 109,5°. Это позволило многим исследователям уде­лять особое внимание построению тетраэдрических мол ел ей ассо­циатов. Появление в ассоциате водородной связи требовало при построениимоделейточного знания её длины (2,79 А°), что стало

13

вторым важным и необходимым обстоятельством в структурных исследованиях и моделировании.

Проблема фиксации структурированного состояния воды за­ключаласьв том, что известное время жизни комплексов с водо­родной связью составляло всего лишь10'¹⁰сек, т.е. все виды ассо- циатов должны были с высокой скоростью обмениваться молеку­лами воды или протонами и, следовательно, не представлялось возможным говорить о некой определённой структуре воды. В свя­зи с этим построение любых моделей становилось чисто умозри­тельным, как бы в предположении мгновенного замораживания, и потому отдавалось предпочтение результатам исследований льда, поскольку условное перенесение геометрических конструкций для льда на жидкое состояние представлялось вполне правомерным. В свою очередь квантово-химические расчёты устойчивости агрега­тов из молекул воды предсказывали высокую вероятность их рас­пада уже при10-12ассоциированных молекулах, что также не спо­собствовало развитию исследований по обнаружению стабильных ассоциатов в воде.

Анализ аномальных свойств воды не выходил за рамки фе­номенологической интерпретации или просто экспериментальной констатации необычного проявления целого ряда физических ха­рактеристик воды и потому не мог служить основанием для каких- то структурных предположений. Действительно, увязать минимум плотности при 4°С, минимум теплоёмкости при 36°С с какой-то оп­ределённой структурной организацией не представлялось возмож­ным из-за полного отсутствия каких-либо принципиальных поло­жений о взаимосвязи этих качественно разных характеристик воды. К поиску решения проблемы структурированого состояния воды

14

подключились учёные, получившие прзнание в области химии. Ха­рактеризуя деятельность одного из таких исследователей, лауреата Нобелевской премии в области химии Жуана Ли в информации ин­тернета[143] указано, что он предпринял попытку разрушить про­иски природы, поставившей загадку, запутаннуюв ребус - структу­ру воды.“Вода таинственна. Она жидкость,когда должна быть га­зом, она расширяется, когда должна сжиматься и она растворяет практически всё, чего касается, дайте только достаточно времени. Теоретики высказывали многочисленные предположения о струк­туре воды, чстобы объяснить её необыкновенные свойства,но ни­чего не было экспериментально подтвержэдено.Трудность возни­кает из-за присутствия в воде гидрониум-иона - молекулы воды с лишним атомом водорода. Атомы водорода гидрониума связыва­ются с атомами кислорода молекул воды, создавая ионизированные молекулярные“кластеры”.“Водородные связи”, которые удержи­вают эти кластеры из молекул воды вместе, так слабы(около10% по силе от средней ионной или ковалентной связи), что кластеры находятся в постоянном состоянии изгиба, соединения и распада примерно раз в каждую десятимиллиардную секунды. Тем не менее ионные кластеры в основном ответственны за уникальность воды. Без них вода при комнатной температуре была бы газом.

Анализ рентгеновских исследований льда вначале предпола­гал существование ионных кластеров воды, но попытки изучить их структуру оказались безрезультатными. Ли анализировал структуру ионных кластеров воды в газе наиболее информативным на его взгляд методом ИК- спектроскопии. Трудность заключалась в ос­новном в наличии очень малой плотности ионов. Чтобы усилить эффект, было использовало накопление.

15

Ли с коллегами смешали ионы водорода со следовыми коли­чествами воды в молекулярном пучке, чтобы образовать ионные кластеры, содержащие одну, две или три молекулы воды, присое­динённые к каждому гидрониум-иону. Пучок затем поступал в ва­куумную камеру, чтобы заморозить нестабильные кластеры в ус­тойчивые образования. Луч от настраиваемого инфракрасного ла­зера использовался для селективного возбуждения колебаний водо­родной связи того типа кластеров, который исследователь выбирал для изучения. В масс-спектрометре возбуждённые кластеры заго­нялись в радиочастотную ионную ловушку, где второй пучок лазе­ра разбивал их путём “диссоциации”их связей. Результирующие фрагменты ионов затем проявлялись и считывались во втором масс-спектрометре для получения ИК-спектра, который можно бы­ло сравнить с теоретическими предсказаниями.

Комбинация в виде тандема системы масс-спектрометра и ра­диочастотной ловушки оказалась идеальной для выявления продук­тов распада. Практически очень мал или отсутствует фон масс ион­ных фрагментов и каждый фрагмент иона может быть идентифици­рован с почти полной определённостью”.

Следует обратить внимание на редко обсуждаемое упомяну­тое выше свойство универсальной растворяющей способности во­ды. Поскольку данное высказывание было сделано лауреатом Но­белевской премии, т.е. заслуживает более пристального рассмотре­ния, можно на стадии общего обсуждения проблемы структуриро­ванного состояния воды сделать следующие выводы и предполо­жения из анализа именно этого свойства.

16

Растворимость в воде есть комплексообразование молекул воды с растворяемым веществом. Универсальная растворяющая способность воды из такого определения растворимости никак не следует.Свеществом должны комплексовать как бы разные по свойствам образования из молекул воды и это, пожалуй, единст­венное разумное предположение, позволяющее связывать структу­ру воды с растворимостью. Однако такое предположение представ­ляется крайне важным, т.к. требование разных образований или структур из молекул воды наводит на мысль о возможности суще­ствования стабильных ассоциатов. На наш взгляд данная мысль может служить предпосылкой для перехода от общего обсуждения проблемы к рассмотрению исследований, анализ результатов кото­рых позволил осуществить формирование новых представлений о структуре воды.

Целесообразно до приведения соответствующих эксперимен­тальных данных, послуживших основой для выбора структурных моделей ассоциатов воды, проанализировать всеобъемлющий тео­ретический обзор [20] по возможным структурам из молекул воды и их роли при образовании структур биополимеров.

В обзоре рассматриваются построения ассоциатов из молекул воды, основанные помимо данных о тетраэдрическом расположе­нии водородных связей и значении их длины на представлении об энергетически наиболее выгодной ориентации в 38°связей, приле­гающих к водородной связи [208]. На этих предпосылках строится универсальный клатрат воды, состоящий из трёх гексациклов“твист-ванна”. Далее определяются количества молекул воды в по­следующих более сложных образованиях.

17

Главным достоинством обзора, несмотря на абсолютизацию некоторых исходных расчётных параметров, является осуществле­ние корреляции структурных образований из молекул воды со структурами белков и нуклеотидов. Такое биологическое примене­ние рассматриваемых представлений обсуждается в данной работе достаточно подробно и интересно. Так по расчётам автора на пару оснований в ДНК должно приходиться не менее16-28 молекул во­ды,а в ионных каналах биомембран иогут образовываться спирали из так называемых“триплетов”воды (по 20 молекул каждый), внутри которой способны проходить ионы Са²⁺,Na⁺,Mg²⁺. Автор считает, что спираль из молекул воды заполняет одну из 2-х бороз­док ДНК шириной 14 А⁰и даже высказывает предположение о том, что”возникновение хирально чистой биосферы, т.е. возникновение жизни,произошло как фазовый переход, потому что эволюцион­ный путь сё появления невозможен”. Последнее утверждение пере­кликается с эмоциональным высказываниемЖ.Ли, что“без таинст­венных свойств воды Земля наша скорее всего была бы в Космосе как безжизненный снежный шар”[143], а также с работами о роли критических явлений при фазовых переходах второго рода в про­цессе самоорганизации неравновесных систем биосферы [58]. Не­обходимость рассмотрения фазовых переходов присутствует также в концепциях матрично-информативной воды [60].

Интересный обзорный материал о реальности влияния гелио- геофизических и химических факторов на структурные особенно­сти жидкой воды содержится в работе [68]. Автор считает, что при рассмотрении вопросов, связанных с установлением механизма влияния гелиогеофизических факторов на живые организмы, суще­ствует предположение, что эти факторы изменяют свойства воды

18

на молекулярном и субмолекулярном уровнях[3]. В плане под­тверждения этого предположения или отказа от него выяснение структурных особенностей и влияния их на свойства жидкой воды представляет большой интерес. Однако, по мнению автора, пока не сложилось однозначного представления о процессах, протекающих в жидкой воде на молекулярном и субмолекулярном уровнях. Аномальные свойства жидкой воды указывают лишь на то, что та­кие процессы протекают и на протяжении многих лет стимулируют появление более или менее искусственных моделей[12,5,31].

Каждая из таких моделей способна охватить лишь некоторую часть особых свойств жидкой воды и довольно уязвима для крити­ки с позиции классических представлений [62,65]. Отсутствие бо­лее или менее удовлетворительной модели процессов, протекаю­щих в жидкой воде, в значительной мере тормозит исследования по выявлению новых особых свойств жидкой воды. Примером такого торможения может служить дискуссия вокруг работы [116], в кото­рой было обнаружено сохранение жидкой водой признаков присут­ствия в ней некоторых биологически активных веществ при трудно вообразимой степени разбавления их растворов.

Описанное в работе [116] элиминирование эффекта передачи информации жидкой водой под влиянием ультразвуковых колеба­ний и нагревания, с одной стороны, и замораживания - таяния - с другой, свидетельствуют о высокой специфичности эффекта: он должен наблюдаться в достаточно узком диапазоне уровней струк­турирования. Вероятно, передача жидкой водой информации о раз­личных веществах, находящихся в растворе, требует различных уровней структурирования. Установление таких уровней - дело бу­дущего. Однако не вызывает сомнений, что в работе [116] удалось

19

смоделировать на лабораторном столе результаты влияния гелиоге- офизических факторов на свойства жидкой воды. Наибольший ин­терес представляют биологические аспекты этой проблемы, кото­рые обсуждаются достаточно давно [31,9]. В разное время пред­принимались достаточно активные попытки дать научное обосно­вание благотворному влиянию на живые организмы жидкой воды, подвергнутой различным видам физического и физико­химического воздействия.

Однако эти попытки нельзя считать удачными. Главная при­чина неудач, по нашему мнению, - неустойчивость положительного эффекта от применения обработанной жидкой воды и трудность научного объяснения подобной неустойчивости. Результаты работ [116,69,59] показывают, что эффекты обработки жидкой воды ос­нованы на её способности к хранению и передаче информации. Не­удачи с использованием обработанной воды, вероятнее всего, свя­заны с содержанием передаваемой информации, которая в биоло­гическом плане может быть как позитивной, так и негативной. Под таким углом зрения становится понятной неустойчивость положи­тельного влияния обработанной воды на живые организмы. Для получения устойчиво положительных результатов необходимо до­биваться высокого уровня применяемых технологий и оптимально­го режима их осуществления. В противном случае применение об­работанной воды может дать результаты,прямо противоположные желаемым. Автор в своей работе [68] приводит данные о непре­рывном образовании - распаде в нейтральной жидкой воде в про­цессе ступенчатой диссоциации иона гидроксония метастабильного незаряженного соединения<H₂O_aq⁺(Н₂О^0,2е)5>,об эффекте сохра­нения жидкой водой признаков присутствия в ней некоторых био­

20

логически активных веществ при бесконечно большой степени раз­ведения растворов и о существовании в электрохимически активи­рованной воде трёх метастабильных форм с различными временами релаксации, что подтверждает реальность влияния гелиогеофизиче-ских и химических факторов на структурные особености жидкой воды. Эти факторы нельзя не учитывать при осуществлении приро­доохранных мероприятий. В частности, одновременный учёт ра­диационного фона, ультрафиолетовой радиации, электрического и магнитного полей или химических факторов должен серьёзно сни­жать уровень предельно допустимых концентраций вредных ве­ществ по сравнению со случаями изолированного рассмотрения каждого из них.

Вероятно, следует с большой осторожностью применять гер­бициды,дефолианты и некоторые удобрения в зонах интенсивного промышленного производства,повышенного радиационного фона или солнечной радиации. Напротив, эффективность средств, оказы­вающих устойчиво благотворное влияние на живой организм, под влиянием перечисленных факторов может быть значительно повы­шена.

С этой точки зрения представялют интерес так называемые дни повышенного гелиогеофизического влияния, устанавливаемые ежемесячно [3]. В настоящее время применительно к таким дням рассматриваются только мероприятия, исключающие для живого организма (будь то человек или животное) ситуации повышенного риска. Однако в такие дни можно ожидать и относительно более сильног овлияния тех факторов, которые оказывают устойчиво бла­готворное влияние на живой организм. Это обстоятельство, вероят­но, следует учитывать приразработке режимов полива и подкормки

21

растений, кормления животных,назначения курсов лекарственной терапии.

Идея изучения ионных кластеров в выше рассмотренных ра­ботах [68, 92,143,166] была также реализована,но без столь обоб­щающих выводов и предположений, в более конкретной физико-химической форме в работах [121-123,125,150-152,176,190Д 91,198,205]. Протонированные водные кластерыНГ(H₂0)_n, п=5 ... 65 и их дейтероаналоги получались под действи­ем низкоинтенсивногоИК-лазера, затем захватывались в электро­магнитную ловушку в условиях отсутствия столкновений. Полу­ченные значения скоростей последующей фрагментации или испа­рения при300°К,отражающие времена жизни фрагментов, показы­вают некоторую специфику в распределении фрагментов по их временам жизни. Некоторые кластеры с количеством молекул воды п-21,п-55 оказались более долгоживущими чем остальные, что представляется существенным фактором при выяснении структур­ных особенностей воды. Кроме того, следует отметить, что доста­точно большое время жизни Н^Т(Н₂0)4 послужило основным обстоя­тельством, указывающим на конечный минимальный продукт фрагментации протонированных кластеров. Однако говорить о прямой связи структурированного состояния невозмущённой воды и в присутствии протонированных кластеров нет никаких основа­ний и можно только предполагать соответствующие корреляции. Привлечение в работе [68] теоретических представлений об элек­тропроводности [4,14,55] с постулированием лэнгмюровских плаз­менных колебаний [14] безусловно углубляет понимание сути про­исходящих процессов в водной среде и, вероятно, может служить связующим звеном во взаимодействии радиации и физических по­

22

лей со структурой воды. К развитию физических теорий о структу­рированном состоянии водной среды относится работа [175] по ис­следованию диэлектрической релаксации с использованием перко- ляционной, т.е. состоящей из мобильных и немобильных образова­ний, модели воды[199], объясняющие аномальное поведение ко­эффициента самодиффузии молекул воды.

Взаимодействие электромагнитных волн (КВЧ) с водой де­тально рассмотрено в многочисленных работах[10,18,24-26], в ко­торых обсуждается вопрос о возможности формирования “памяти воды”при воздействии электромагнитных волн на воду и водные растворы и где показано, что “память воды” может быть связана, например, с метастабильными состояниями в водных образованиях(кластерах, клатратах).

Неожиданными и оригинальными представляются работы по обнаружению люминесценции чистой воды [64], что заставляет по-новому взглянуть на проблему структурированного состояния во­ды. Можно полагать, что структуру воды следует рассматривать в неразрывной связи с электромагнитным равновесием в растворе и в окружающей среде. Столь фундаментальный вывод становится су­щественным обоснованиемсуществующих объяснений влияния слабых полей на биологические системы[128].Подтверждением наличия распределения электромагнитной энергии в растворе слу­жит работа[105] о неравновесном распределении возбуждения под действием наносекундных импульсов лазера между молекулами, связанными водородной связью, и свободными молекулами воды.

Рассмотрение естественных образований в воде и их взаимо­действие с электромагнитным излучением было бы неполным без

23

упоминания о естественных примесях - молекулярном кислороде и перекиси водорода. О роли перекиси в структурировании воды появилось много работ, однако для подхода к проблеме выявления определённых структур в воде оказалась интересной работа [30], в которой экспериментально обосновано предположение о механо- химической и,следовательно, естественной, самопроизвольной ге­нерации перекиси. Связь со структурой из этого обоснования полу­чается за счёт того, что механический сдвиг молекулярных образо­ваний может привести к разрыву связей только в том случае, если сдвигаемый ассоциат оказывается достаточно жёстким. Вывод о возможности существования таких структур представляется уже чрезвычайно значимым. Конечно, существуют также и другие пути естественного образования перекисей. Так о стимуляции образова­ния перекисей отрицательными гидроаэроионами говорится в ра­ботах[61,154]. Аэроионы упорядочивают структуру воды [61] и вместе с перекисью стимулируют активность ферментов [154].

Отдельную, хотя и близкую к сверхмалым дозам, область ис­следований составляют потенцированные разбавления, в результате которых получается “раствор”с практическим отсутствием разбав­ляемоговсщества. Проблема состоит в том, что такие “растворы”оказывают реальное воздействие, например, вызывают дегрануля­цию базофилов [116], что можно объяснить лишь за счёт “памяти воды”. Следовательно, и такие экспериментальные данные свиде­тельствуют о вполне определённом устойчивом структурированииводы.

Убеждаясь в наличии большого экспериментального мате­риала, подтверждающего мысль о наличии неких водных структур, нельзя забывать о другом уровне рассмотрения, связанном с воз­

24

действием ассоциатов из молекул воды на биоорганические соеди­нения. Дело в том, что только при зависимости органических структур и их функционирования от структурированного состояния воды имеет смысл говорить о важности изучения проблемы струк­туры воды для биологии. Поэтому к поднятым и рассмотренным выше вопросам изучения процессов структурирования воды следу­ет добавить представления о структурном состоянии в водных рас­творах биологически важных соединений. Поскольку в данной ра­боте исследовано состояние нуклеотидов в водных растворах, то целесообразно остановиться на некоторых литературных данных о свойствах нуклеиновых кислот в водной среде.

1-2. Общее представление о конформации и межмолекуляр- ном взаимодействии нуклеотидов в водных растворах.

Рассмотрение данных о структуре нуклеотидов в растворе приводит к выделению некоторых ключевых характеристик нук­леотида,включающих конформационные равновесия кольца рибо- зы и дезоксирибозы,предпочтительные ориентации экзоцикличе- ской и фосфатной групп и ориентацию основания относительтно кольца рибозы.

При анализе конформационного состояния рибозы применя­ется понятие “псевдовращательного цикла”[93-94], введённое ра­нее в работе [153] и развитое в работах [82,95-97,134].Количест­венное описание в терминах псевдовращательного цикла основано на внутреннем соотношении между пятью торсионными углами в не планарном пятичленном кольце. Точное положение на псевдо- вращательном пути определяется, если известны два или более тор­сионных углов из эксперимента [96].Изменение торсионного угла

25

между какими-либо двумя связями влечёт за собой соответствую­щие изменения торсионных углов между остальными связями в цикле, т.е. конформационные изменения в рибозном цикле взаимо­обусловлены. Вывод о взаимообусловленности конформационных процессов в рибозе представляется важным с точки зрения общего представления о конформации нуклеотидов в растворе. Результаты исследования конформации по экзоциклической связи Сд,- С₅, и С₅,

- 0₅, приводят к выводу о предпочтительных гош-гош ротамерах по связямС4,- С₃, иС5,-0₅, для всех изученных 5¹- нуклеотидов. Со­ответственно экзоциклическая боковая цепь существует в основном в расположении “все связи - транс”.

Эти результаты указывают на удивительное постоянство ри-бозофосфатных конформационных характеристик повсюду в серии 5^;- нуклеотидов. Более того, сравнение с кристаллографическими данными показывает, что структуры в растворе только слегка отли­чаются от структур в кристаллическом состоянии [117]. Хотя дан­ные, вероятно, соответствуют гипотезе о“жёсткой”нуклеотидной структурной единице [209] важно отметить, что структуры нуклео­тидов в растворе при точном рассмотрении являются динамиче­ским усреднением быстро конвертируемых конформеров.

В работе [117] указано, что в нуклеотидах изменение насе­лённости гош-гош ротамеров по экзоциклической боковой цепи ведёт к изменению конформационного равновесия в рибозе и к из­менению взаимной ориентации основания и рибозы. Это свиде­тельствуето внутренней зависимости ключевых характеристик мо­нонуклеотидов.

26

На основании выше изложенных фактов можно представить конформацию нуклеотидов в растворе как“лабильно устойчивую”конформацию, т.е. движения отдельных фрагментов нуклеотидов вероятно оказываются синхронными, и этим периодически обеспе­чивается вполне определённое пространственное расположение всех фрагментов молекулы(рис.1). Физически взаимосвязь выде­ленных конформационных изменений очевидна, поскольку все процессы происходят на одной механической основе - остове моле­кулы. (Эффект взаимовлияния механически связанных волчков или маятников).

На рис.1представлены предпочтительные ротамеры по каж­дой из определяющих конформацию пуринового нуклеотида связи. По связи 0₅, - С₅, - ротамер гош- гош, по связи С₅, -С₄, также рота­мер гош - гош,в рибозе осуществляется равновесие между конфор- мерами, по связи С_ь-Nориентация гетероцикла относительно ри­бозы-анти.

Представления о конформации нуклеотидов в растворе необ­ходимо всегда рассматривать наряду с межмолекулярными взаимо­действиями нуклеотидов. Свободные вращения отдельных групп мононуклеотидов в растворе с возрастанием концентрации будут всё более подвергаться различным видам межнуклеотидного взаи­модействия, естественно, с участием растворителя, т.е. водной сре­ды. Поэтому изучение свойств отдельных нуклеотидов, играющих уже в таком виде важную роль в биологических процессах

27

-°''^C('S’}^С(5'Г^СМ~~^c(^^C(t) ~‘^Aj

^C(y)~C{2<)

а) гош-гогаб)гош-гош в) смесь г) анти

Рис. 1Предпочтительная конформация пуриновых нуклеотидов в водном растворе.

28

Пояснение к рис. 1“Предпочтительная конформация пурино­вых нуклеотидов в водном растворе.

В верхней части рисунка указаны связи, вращение вокруг ко­торых определяет конформацию нуклеотида. В средней части пред­ставлены собственно преимущественные ротамеры по каждой свя­зи за исключением рибозного цикла, где пунктиром показаны все­возможные конформеры.По связиО5,-Cj, реализуется гош - гош ротамер, в котором проекция 0₅,-Р₅,связи на плоскость, перпен­дикулярную 0₅, - С₅,связи расположена между протонами Н₅,и Н₅»(рис.1а). По связи С₅, -С4,реализуется гош - гош ротамер, в кото­ром проекция атома кислорода фосфатной группы на плоскость, перпендикулярную С₅,- С4, связи расположена между атомами 0|, и С₃,рибозы (рис.1б), В рибозном цикле показаны возможные от­клонения атомов С₂₎и С₃, от плоскости, проходящей через атомыС*,-Oi,- С_ь•По связи С_ь-Nреализуется анти расположение ге­тероцикла и рибозы. Показаны атомыCsи С₄гетероцикла и атомыО_ь,Hi,иС2,рибозы в их проекции на плоскость, перпен- дикулярную С-NсвязиЛ[83,85,90,178] явилось бы неполным без учёта возникновения ассоциатов, влияющих на внутримолекуляр­ные соотношения в мононуклеотиде,а также явлений гидратации и протонного обмена. В реальных биохимических системах каждая молекула нуклеотида постоянно находится во взаимодействии с друними молекулярными структурами. Именно такое нековалентно связанное состояние отдельного нуклеотида и следует рассматри­вать как биологически используемое. Конечно наиболее корректно

29

при изучении свойств нуклеотидов наблюдать их непосредственно в биологической среде. Однако отсутствие прямых эксперимен­тальных методов, позволяющих следить за поведением отдельных молекул в сложной системе, исключает в настоящее время получе­ние такой информации. Используемый в работе методядерного магнитного резонанса (ЯМР) даёт возможность при достаточно больших концентрациях в системах, содержащих небольшое коли­чество разных видов молекул (2-3, иногда и больше) следить за от­дельными молекуляами и получать данные об их свойствах. В пер­спективе метод ЯМР может приблизиться по своим характеристи­кам к методу, работающему на молекулярном уровне в естествен­ных биологических системах. В данный момент, однако, приходит­ся использовать другой путь исследования механизма сложных процессов - от простого к сложному.Современные работы по при­менению метода ЯМР к изучению ассоциации нуклеотидов исполь­зуют этот путь двояко. С одной стороны, действительно выбирают наиболее простые системы с минимально возможным количеством компонентов. С другой стороны, при невозможности упростить изучаемую систему, применяют упрощённые способы описания её поведения. Как правило,первый путь приводит к выяснению меха­низма отдельных элементарных взаимодействий, но количествен­ное описание какого-либо сложного процесса, включающегоэливзаимодействия, оказывается затруднительным. Второй путь даёт как бы сразу описание суммарного действия отдельных процессов, но, к сожалению, суммарный эффект часто описывается рядом предположительных механизмов и выбор истинного механимза обычно лежит за пределами такого подхода. Прежде чем рассмат­ривать данные об ассоциации нуклеотидов необходимо охаракте-

30

ризоватъвлияние на состояние нуклеотидов в воде процессов.гид­ратации и процессов протонного обмена.

В нуклеотидах присутствуют различные группы, способные образовывать водородные связи с молекулами. Для примера рас­смотрим молекулу аденозин-б^фосфата.

Рис.2 Структура аденозин - 5^/-фосфата.

31

Акцепторными по отношению к молекулам воды являются фосфатная группа, ОН-группа рибозы, NH₂-rpynnaи атомыN-I,N~3,N- 7,N-9 аденинового основания. Вероятно из-за стерических препятствий не следует ожидать максимального возможного запол­нения всех центров образования водородных связей. Поэтому оп­ределение количества молекул воды, связанных с нуклеотидом, оказывается трудной задачей, которая решается только в некото рых спцифических системах. В работе [213] на основе анализа хи-

17

мических сдвигов линий поглощения в спектрах ЯМР - О опреде­лено количество молекул воды во внутренней координационной сфере комплекса Мп⁺⁺- АТФ (3молекулы воды). В работе [159] предложена структура такого же комплекса, причём одна из моле­кул координационной воды одновременно координирует с метал­лом, связанным с фосфатными группами [131], и образует водород­ную связь с атомомN- 7 аденина. Наличие связанной воды обна­руживается при подходе ионов металла к нуклеотиду. Например, для молекул АДФ и АТФ основным моментом, определяющим ско­рость образования комплекса сMg*,является удаление молекул связанной воды, препятствующей подходуMg**к нуклеотиду [132]. Очевидно, что такое же препятствие окажется также и на пути сближения двух нуклеотидов, т.е. при их ассоциации. Критерием определения путей подхода с этой точки зрения(не учитывая дру­гие факторы)может быть выбрано минимальное количество уда­лённых молекул связанной воды при ассоциации. Следующим фак­тором, влияющим на межмолекулярное взаимодействие нуклеоти­дов, является протонирование отдельных групп в нуклеотиде.

Взаимодействие нуклеотидов происходит при определённом значении pH среды. В зависимости от pH отдельные группы ну к-

32

леотидов мгут оказаться протонированными или непротонирован-ными. В случае, если величина рК какой-либо группы лежит далеко от нормальных значений pH (например,рК<3или рК>10), то из­менения заряда группы не происходит, однако может осуществ­ляться обмен протонами с молекулами воды. Указанные процессы могут заметно повлиять на степень ассоциации нуклеотидов. Из­вестно, что обмен протонов амино групп мононуклеотидов катали­зируется Н₃0⁺, ОН',фосфатом и сильно зависит от температуры [169]. Для процессов обмена протонов в макромолекуле принята традиционная формула [163]:“Закрытая”(необменивающаяся)

форма к|/=/кг“открытая”(обменивающаяся) форма (кз) - об­мен, Наблюдаемая константа скорости обмена(к_н)выражается в виде: к„=kiк₃/(к₂+к₃) [163]. Данная формула обмена

хорошо демонстрирует взаимное влияние обмена и “закрытости”макромолекулы. В процессе ассоциации степень закрытия от обме­нивающихся протонов несомненно может меняться, соответственно и состояние обменивающихся групп также изменится. По ушире- нию линииЫН₂-группы методом ЯМР измерены константы скоро­сти обмена протонов, являющиеся количественными характеристи­ками состояния амино группы в процессе протонного обмена [118,124]. Из кольцевых азотов в аденине местом протонирова­ния служитN-1[111]. Методом ЯМР определено также значение рК=2,6 для протонированияN-7 гуанозина [196], что совпадает с ИК[173] и УФ [104] данными. О протонировании азотов пятичлен­ных циклов (типаN-9 аденина) указывается при исследовании ме­тодом ЯМР-N¹⁴[188]. Измерены также скорости обмена протонов амино групп цитозина [170], тиамина [203],аденозина и гуанозина[168]. О времени нахождения одного из амино протонов на атомеN

33

- 3пиримидинового кольца указано в работах [161-162]. Удаление протона при диссоциации может влиять на образование водород­ных связей в комплексе. Это показано на примере изучения кри­сталлической структуры ц-ЦМФ [99]. В этом случае наблюдается непосредственнаяNH...ОР связь. Справедливость распростране­ния подобных данных в кристалле на растворподтверждается дру­гими исследованиями с использованием метода ЯМР [160]. Про­цессы ассоциации оказывают непосредственное воздействие на протонный обмен [102,171]. Как показано в работах[103,106,172] протоны амино группы,не связанные внутримолекулярной водо­родной связью и стерически доступные молекулам растворителя, обмениваются быстрее (хотя всего в несколько раз), чем протоны во внутримолекулярных водородных связях. Утверждение, что ско­рости обмена протонов мономера и полиассоциата не должны сильно отличаться [169], оказалось справедливым и при рассмотре­нии протонного обмена в нуклеиновых кислотах [172]. Обмен ме­нее доступными протонами между цепями спирали не сильно уменьшается по сравнению с затруднённым обменом в мономер­ных единицах [102,172]. Этот неожиданный результат привёл к пе­ресмотру структурных и химических представлений о факторах, инициирующих обмен в макромолекулах[169].

Таким образом,взаимодействие нуклеотидов с растворите­лем, наличие процессов протонизации и протонного обмена долж­ны не только учитываться при рассмотрении межмолекулярных взаимодействий нуклеотидов, но и являться объектом предшест­вующих наблюдению за ассоциацией нуклеотидов исследований.

Исследование межмолекулярной ассоциации оснований, нук- леозидов и нуклеотидов методом ЯМР впервые было осуществлено

34

в работе [106]. С точки зрения авторов основной наблюдаемый эф­фект в спектрах ЯМР - сдвиг линий поглощения протонов основа­ний с увеличением концентрации веществ свидетельствовал о на­личии межмолекулярной ассоциации. Более того, для ряда соеди­нений были рассчитаны на основании концент рационных зависи­мостей химического сдвига эффективные константы ассоциации. В отличие от известного при обычном межмолекулярном взаимодей­ствии сдвига сигналов в сторону слабого поля [35,36,73] для дан­ных систем оказался характерным сдвиг в сторону сильного поля. Подобный эффект был объяснён образованием ассоциатов с парал­лельным расположением гетероциклов. В этом случае взаимное влияние кольцевых токов или более правильно влияние магнитной анизотропии одного гетероцикла на протоны другого, приводящее к локальному уменьшению величины постоянного магнитного по­ля, в котором расположены образцы, оказывается фактором, сдви­гающим сигналы в сторону сильного поля. При разбавлении рас­творов и, соответственно, распаде ассоциатов происходит сдвиг линий поглощения в сторону слабого поля[103]. Нарушение стоп­ки оснований в растворе при повышении температуры[103, 141-142,158,196] или замене растворителя на менее полярный [106] приводит к такому же действию, т.е. к сдвигу линий поглощения в сторону слабого поля. “Стэкинг’-взаимодействие ароматических циклов в воде является основным и для таких систем как основания нуклеиновых кислот - ароматические аминокислоты. Протонный магнитный резонанс удобен для изучения подобных систем и во­обще для изучения комплексообразования между ароматическими молекулами в растворе [98,113,130,139]

35

Новым этапом в изучении реального взаимодействия ком­плементарных оснований в биохимических средах явилось доказа­тельство наличия водородных связей между нуклеотидами в воде [184-185]. По данным ЯМР амино группы АМФ, ГМФ и ЦМФ имеют в спектре ЯМР линии, которые сдвигаются в сторону слабо­го поля в смеси нуклеотидов. Таким образом, наряду с гидрофоб­ным взаимодействием гетероциклов в воде методом ЯМР удалось наблюдать образование водородных связей(не обязательно между комплементарными основаниями). Другие методы, как хромато­графия и растворимость [135,183,206], а также осмометрические измерения[196] и метод Раман спектроскопии [167] оказались не­способными разделить“стэкинг”-взаимодействие и образование водородной связи. При помощи метода ЯМР можно детально изу­чать образование водородной связи между нуклеотидами. Наблю­даемое уширение линий поглощения протонов амино групп нук­леотидов происходит не только вследствие наличия квадрупольно- го момента азота, что может быть установлено из экспериментов по гетероядерной развязке [144], а связано с процессами ассоциации. Возможность наблюдения методом ЯМР за водородной связью ме­жду нуклеотидами в воде кажется необычной вследствие того, что протонный обмен между амино группами и водой должен был при­вести к исчезновению линии поглощения протонов амино групп и слиянию этой линии с сигналом от протонов воды. То, что этого не происходит, говорит об ограничивающем влиянии гидрофобного “стэкинг”-взаимодействия на подход молекул воды к центрам об­разования водородных связей нуклеотидов, В результате этого влияния появляется возможность образования водородных связей

36

между нуклеотидами. Возможно также образование водородной связи между основаниями ДНК и белком [193].

Как видно из приведённых данных по изучению “стэкинг”-взаимодействия нуклеотидов, основным недостатком применявше­гося анализа данныхЯМР является отсутствие строгого физико­химического рассмотрения зависимостей величин химических сдвигов протонов оснований нуклеиновых кислот от их концентра­ции. Проведение такого исследования возможно только в том слу­чае, когда экспериментально получаются результаты, характери­зующие отдельные стадии ассоциации. Кроме того, должна быть уверенность в элементарности той стадии, информация о которой содержится в экспериментальной кривой. Поэтому для получения корректных данных о механизме ассоциации нуклеотидов необхо­димо прежде всего выбрать соответствующие условия, в которых можно говорить об извлечении данных, характеризующих элемен­тарные стадии ассоциации.

Рассмотрение проблемы структурированного состояния вод­ной среды и её влияния или участия в биологических процессах имеет существенную особенность.Несмотря на реальное воздейст­вие молекул воды на конформацию и процессы ассоциацииразлич­ных биомолекул, анализ существующих данных оставляет впечат­ление разобщённости биохимических превращений и структурных изменений воды. На наш взгляд, такое разделение обусловлено ис­торическим развитием науки и преодолеть сложившийся годами стереотип представляет собой больше психологическую трудность нежели научную задачу. Правда, не следует недооценивать и пси­хологический фактор, поскольку он подкреплён многочисленными модельными экспериментами в неводных средах, где взаимодейст-

ы

вне биологических объектов выступает как бы в независимом от воды виде.

Не умаляя значимости разноплановых научных опытов, кото­рые действительно по элементарным взаимодействиям во многом проясняют механизм биологических процессов,всё-таки следует подчеркнуть,что естественное протекание реакций в организме происходит главным образом в водной среде. Поэтому взаимосвязь структурированного состояния воды с упорядоченной последова­тельностью превращений в биологических системах не представля­ется в какой-то мере искусственной или рассматриваемой по необ­ходимости,а составляет неотъемлемуючасть единого функциони­рования организма.Наиболее приемлемым представлением, разви­ваемым в настоящей работе,служит, по мнению автора, матричное представление водной среды,когда определённая совокупность элементов матрицы соответствует или даже предназначена для подхода к ней определённого нуклеотида или аминокислоты, нук­леиновой кислоты или белка.

Подходить к такому представлению пришлось осторожно,не нарушая привычного академического хода исследований, посколь­ку только в последовательных экспериментах по изучению свойств биологических соединений в водной среде постепенно проявлялась роль воды и вырисовывалась возможность гармоничного описания единого водно-органического процесса превращений.

38