![](/user_photo/2706_HbeT2.jpg)
Praktikum_Klimnyuk
.pdf![](/html/2706/380/html_BOh9no_zrM.2tbJ/htmlconvd-gM9GOT231x1.jpg)
Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань |
|
231 |
||||||
Схема постановки об’ємної реакції аглютинації |
Таблиця 47 |
|||||||
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Компоненти, мл |
|
|
Номери пробірок |
|
|
|||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 КС |
7 КД |
||
|
||||||||
0,85 % розчин хлориду натрію |
– |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Сироватка хворого, 1:25 |
05 |
0,5 |
|
|
|
0,5 |
– |
|
Діагностикум туляремійний |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
– |
0,5 |
|
Розведення сироватки |
1:50 |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:50 |
– |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму.
Пробірки струшують і ставлять у термостат на 2 год, потім витримують 1820 год при кімнатній температурі і аналізують результати. Діагностичне значення має титр 1:100. Така концентрація антитіл настає в кінці 2-го тижня, після чого титр аглютинів наростає у 4-8 разів, в той час як у перехворілих раніше він залишається практично незмінним.
Кров’яно-крапельну реакцію аглютинації вживають як прискорений орієнтовний метод діагностики туляремії, особливо при масових обстеженнях. На ретельно знежирене скло беруть товсту краплю крові з пальця хворого. До неї додають такий же об’єм дистильованої води, щоб викликати гемоліз. Поряд наносять краплютуляремійногодіагностикуму(5 млрдмікробнихтілу1 мл). Обидвікраплі змішують скляною паличкою. При наявності у хворих титру антитіл 1:100 і вище аглютинація на склі наступає негайно, при більш низьких титрах – через 2-3 хв. У всіх хворих із позитивною кров’яно-крапельною пробою ставлять об’ємну реакцію аглютинації.
Дужечутливимметодомсерологічноїдіагностикитуляреміїєреакціянепрямої гемаглютинації. Вона ефективна як при ранній, так і при ретроспективній діагностиці, а також для визначення рівня антитіл після вакцинації. Антигеном для РНГА служить туляремійний еритроцитарний діагностикум (консервовані формаліном баранячі еритроцити, сенсибілізовані туляремійним антигеном). МетодикапостановкиРНГАпритуляреміїтакасама, якіприбруцельозі. Гемаглютинаційні титри сироваток у хворих досягають 1:1280-1:2560 і вище.
Високочутлива і специфічна непряма реакція імунофлуоресценції. Діагностикум для РІФ є завись вакцинного штаму туляремійних бактерій в концентрації 500 млн/мл. Сироватку розводять від 1:5 до 1:640. Діагностичним титром вважаютьрозведення1:40 ібільше, якедаєяскравесвітінняповерхнімікробнихклітин. Позитивна РІФ буває також у перехворілих раніше і вакцинованих.
ДляранньоїдіагностикитуляреміївикористовуютьтакожРЗКнахолоді. Кров
ухворогоберутьвкінці1-готижнязахворювання, антигеномслужитьдіагностикум.
Уприродних осередкахтуляремії дляконтролюзарозвиткомепізоотійсеред гризунів використовуютьРНГАтаІФАзметою виялення антигенів у тушках гризунів і птахів.
Алергічні пробивіднесенідоранніхівисокоспецифічних методівдіагностикитуляремії. Вонистаютьпозитивнимивжез3-5-годняхвороби. Дляпостановки
232 |
Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія |
проб використовують 2 препарати тулярину. Перший містить 500 млн бактерій в 1 мл, другий – 10 млрд. Відповідно використовують внутрішньошкірний метод введеннятуляринузменшоюконцентрацієюмікробнихтілінашкірний– длябільш концентрованого препарату.
Для постановки внутрішньошкірної проби 0,1 мл тулярину вводять у шкіру передпліччя. При постановці нашкірної проби на зовнішню поверхню плеча наносять краплю тулярину і через неї роблять 2 паралельні насічки довжиною 8- 10 мм, плоскимбокомперавтираютьпрепаратвнасічки. Реакціювраховуютьчерез 24 і 48 год. За позитивну пробу вважають розвиток інфільтрату діаметром 5 мм і більше. Позитивна проба протягом кількох років залишається у перехворілих і вакцинованих осіб.
Бруцельоз
Бруцельоз – хронічна або гостро-хронічна зоонозна інфекційна хвороба з рецидивним довготривалим перебігом, ундулюючою гарячкою, переважним ураженням опорно-рухових органів, нервової та сечостатевої системи. Збудниками його є декілька видів бактерій, об’єднаних у рід Brucella: B.melitensis, B.abortus, B.suis, B.ovis, B.сanis, B.neotomae.
Із всіх видів найбільш патогенною для людини є B.melitensis. Вона викликає 95-97 % всіх випадків бруцельозу, на долю B.abortus припадає 1-3 %, ще рідше захворювання викликає B.suis (менше 1 %). Пізніше від баранів, хворих на епідидиміт, виділилиB.ovis,відчагарниковихщурів–B.neotomae, відгончихсобак–B.canis.
Брецели мають добре виражені антигенні властивості. Вони містять поверхневий Vi-антиген і видоспецифічні соматичні А і М, кількісне співвідношення яких неоднакове у різних видів. У B.melitensis переважає М-антиген, у B.abortus і B.suis – антиген А. Для ідентифікації бруцел використовують монорецепторні сироватки.
Основниминосіями бруцелєкози, вівці(B.melitensis), великарогата хвороба (B.abortus), свині(B.suis) іпівнічніолені(B.rangiferis). Відхворихтваринзбудник виділяється з молоком, сечею, випорожненнями і особливо з навколоплідними водами під час окотів і отелів. Людина заражується від тварин контактно-побуто- вимшляхомабочерезсиремолокоімолочніпродукти. Захворюванняноситьпрофесійний характер. Найчастіше хворіють пастухи, доярки, ветеринарні працівники, скотарі.
Лабораторнудіагностикубруцельозупроводятьзадопомогоюбактеріологічних і серологічних досліджень, біологічної та алергічної проб, а також методу ДНК/ДНК гібридизації.
Матеріаломдлядослідженняможебутикров, кістковиймозок, фекалії, жовч, сеча, ліквор, харкотиння, пунктат лімфатичних вузлів, у тварин – викидні, навколоплідні води, а також молоко і молочні продукти.
У зв’язку з частими лабораторними зараженнями бруцельозом виділення чистих культур і зараження гвінейських свинок дозволяють проводити лише у
Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань |
233 |
спеціальних режимних відділах санепідемстанції. Серологічні дослідження виконують у звичайних бактеріологічних лабораторіях.
Бактеріологічнедослідження. Длявиділеннягемокультуризліктьовоївени беруть 10-20 мл крові й порівно засівають у два флакони з печінковим, сироватковим декстрозним бульйоном або МПБ із глюкозою, гліцерином і антифаговою сироваткою для пригнічення бруцельозного бактеріофагу. Один флакон інкубують у звичайних аеробних умовах, другий – в атмосфері 10 % CО2 (для росту B.abortus). Особливістю бруцел є дуже повільний ріст на середовищах при виділеннівідхворих, тому посівислідвитримувативтермостатідо4-5 тижнів, роблячи висіви на елективні агари кожні 4-5 днів. Найкращим середовищем для вирощування бруцел є сироватковий декстрозний агар (МПА, 5 % сироватки, 1 % декстрози). Дляприскореннядослідженняпосівикровіпроводятьудвапрямокутних флакони за методом Кастанєди. Флакони містять, крім бульйону, ще й шар агару наоднійабообохстінках. Починаючиз4-годняпісляпосіву, флакониперіодично похитуютьдлятого, щобзроситибульйоном поверхню агару. У випадку позитивного результату на агарі виростають колонії бруцел, які відсівають на елективні середовища й проводять ідентифікацію. Якщо протягом місяця колонії не ростуть, роблять висів із бульйону на щільне середовище.
Отримання гемокультури є одним із основних методів бактеріологічної діагностики бруцельозу у людей. Якщо хворобу викликає B. melitensis, гемокультура висівається у 65-90 % випадків, при зараженні B. abortus – у 5-15 %. Інколи гемокультура виростає вже з перших днів гарячки.
Хороші результати в гострій і хронічній стадіях хвороби дають посіви пунктатівкістковогомозку. Мієлокультурувдаєтьсявиділитив2 разичастіше, ніжгемокультуру. Кілька крапель аспірату кісткового мозку засівають у дві пробірки з тим жесередовищем. Сечудлявиділенняуринокультуриіжовчдлявиділеннябілікультури, а також молоко спочатку центрифугують. Із осаду або вершків роблять висів по 0,1-0,2 мл на чашки з агаром “Д”, (або печінковим), до якого додають генціановийфіолетовийурозведенні1:200 тис. длязатриманняростусупутньоїмікрофлори.
Дуже ефективні посіви матеріалу в жовток курячих жирових (незапліднених) яєць або в жовтковий мішок курячого ембріону. Кров хворого або аспірат кісткового мозку розводять бульйоном 1:3 і по 0,1-0,2 мл інокулюють у декілька яєць. Заражені яйця інкубують при 37 оС 5 днів і по 0,5 мл їх вмісту висівають на рідкі й щільні середовища. Ріст бруцел спостерігається вже через 2-3 дні.
Якщо посівний матеріал (фекалії, сеча, харкотиння, гній тощо) контамінові сторонніми мікробами, його спочатку центрифугують, осад розводять генціановим фіолетовим у 3-5 разів і по 0,2 мл вносять у яйця чи ембріони з наступним висівом на елективний агар.
Колонії бруцел на агарі дрібні (0,1-0,5 мм), круглі, опуклі, гомогенні з перламутровим відтінком. Бруцели можуть утворювати як S-, так і R-форми колоній (особливо B. ovis, B. suis і B. canis). Із помутнілого бульйону і типових колоній виготовляють мазки, забарвлюють за Грамом і відсівають на скошений агар для виділення чистої культури.
![](/html/2706/380/html_BOh9no_zrM.2tbJ/htmlconvd-gM9GOT234x1.jpg)
234 |
Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія |
Ідентифікаціякультурпроводитьсязаморфологічними, культуральними, біохімічними властивостями і на основі реакції аглютинації видовими і монорецепторними сироватками. Тепер є надійні тести для диференціації основних видів і біоварів бруцел (табл. 49).
|
|
Диференціація основних видів і біоварів бруцел |
Таблиця 49 |
||||||
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Виді- |
Ріст на агарі з |
Аглютинація |
|
|
||
|
Біо- |
Потре- |
моноспецифічними |
|
Лізис |
||||
|
барвниками |
|
|||||||
Вид |
лення |
сироватками |
|
||||||
|
вар |
ба СО2 |
H2S |
|
|
|
|
|
фагом |
|
Тіонін |
Фуксин |
Brucella |
Brucella |
|
||||
|
|
|
|
abortus |
melitensis |
|
|
||
Brucella |
1 |
– |
– |
+ |
+ |
– |
+ |
|
– |
melitensis |
2 |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
|
– |
|
3 |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
– |
Brucella |
1 |
+ |
+ |
– |
+ |
+ |
– |
|
+ |
abortus |
2 |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
|
+ |
|
3 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
– |
|
+ |
|
4 |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
|
+ |
|
5 |
– |
– |
+ |
+ |
– |
+ |
|
+ |
|
6 |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
|
+ |
|
7 |
– |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
|
8 |
– |
– |
+ |
+ |
– |
+ |
|
+ |
|
9 |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
+ |
|
+ |
Brucella |
1 |
– |
+ |
+ |
– |
+ |
– |
|
– |
suis |
2 |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
|
– |
|
3 |
– |
– |
+ |
+ |
+ |
– |
|
– |
|
4 |
– |
– |
+ |
– |
+ |
+ |
|
– |
Біологічна проба. Найбільш чутливими лабораторними тваринами є гвінейськісвинкиібілімиші. Дозараженнятварин вдаютьсятоді, коли досліджуваний матеріал сильно забруднений сторонньою мікрофлорою і висіяти з нього чисту культуру важко. Кров хворих, ліквор, ексудат із суглобів вводять у черевну порожнину (гвінейським свинкам 2-3 мл, мишам – 0,5-1,0 мл). Осад сечі, навколоплідних вод, молока вводять підшкірно в пахвинній ділянці. Через 20-30 днів після зараження проводять розтин тварин, сіють кров із серця та емульговані паренхіматозні органи і лімфатичні вузли на рідкі й щільні елективні середовища. Перед посівомусвинокберутькровізсерцядляпостановкиреакціїаглютинації з метою виявлення антитіл. Позитивною біопробу вважають тоді, коли виділяють бруцели будь-якого виду, або при позитивній реакції аглютинації в розведенні сироватки 1:20 і більше.
Для виявлення бруцельозних антигенів у сироватці крові, які можуть бути вільними або у вигляді циркулюючих імунних комплексів, застосовують РНГА в разі використання еритроцитарних діагностикумів з моноклональними антитілами до родоспецифічних антигенів бруцел. Використовують також реакцію коаглютинації та преципітації, а також метод імуноферментного аналізу.
![](/html/2706/380/html_BOh9no_zrM.2tbJ/htmlconvd-gM9GOT235x1.jpg)
Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань |
235 |
Серологічні дослідження при бруцельозі включають реакцію аглютинації Райта, прискорені пластинчасті реакції на склі: Хеддлсона, роз-бенгал, латексаглютинації, непряму реакцію гемолізу. Із об’ємних серологічних реакцій використовують РЗК, реакцію Кумбса (для виявлення неповних антитіл), РНГА, ІФА, РІФ, опсонофагоцитарну пробу. З них найчастіше використовують реакції Райта, Хеддлсона і РНГА.
Реакція Райта – один із основних офіційних методів діагностики бруцельозувусіхкраїнах. Вонапростазатехнікоюпостановки, доситьчутливаіспецифічна, виявляєтьсянапочаткузахворювання, досягаєдіагностичноготитрунадругому тижні й зберігаєтьсяпозитивноюпротягом1-4-хроків. Отже, їїможна використовувати як для діагностики гострого періоду хвороби, так і для встановлення ретроспективного діагнозу. Реакцію ставлять за класичною схемою в пробірках методом однакових об’ємів (табл. 50).
|
Схема постановки реакції аглютинації Райта |
|
Таблиця 50 |
||||||
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Компоненти, мл |
|
|
Номери пробірок |
|
|
|
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 КС |
|
7 КД |
|
|
|
|
|||||||
|
0,85 % карболізований |
– |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
0,5 |
|
розчин хлоридунатрію |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Сироватка хворого 1:25 |
0,5 |
0,5 |
|
|
|
0,5 |
|
– |
|
Бруцельозний |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
– |
|
0,5 |
|
діагностикум 1:10 |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Розведення сироватки |
1:50 |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:50 |
|
– |
Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму.
Сироватку хворого і діагностикум розводять ізотонічним розчином хлориду натрію, до якого заздалегідь додають 0,5 % фенолу (карболізований ізотонічний розчин). При постановці реакції Райта і Хеддлсона використовують єдиний бруцельозний діагностикум, який є 10 млрд зависсю убитих нагріванням і фенолом бруцел, забарвлених аніліновим барвником у синій колір. Перед постановкою реакції його розводять у 10 разів.
Пробірки струшують і ставлять у термостат на 18-20 год, потім ще витримують 2 год при кімнатній температурі й враховують результати звичайним способом або по 50 % аглютинації (2+). Серійні розведення 50 % аглютинації 1:50, 1:100-1:800 свідчить про те, що 1 мл сироватки хворого містить відповідно 50, 100 ... 800 МОантитіл. Інтенсивність реакціїоцінюютьзатакою схемою: 50 МО– реакція сумнівна, 100-200 МО – позитивна, 400-800 МО – різко позитивна. Реакція Райта може бути позитивною у перехворілих раніше і у щеплених осіб, тому з розвитком хвороби її ставлять повторно і враховують наростання титру антитіл.
Часто використовують мікрометод реакції аглютинації на склі – пластинчастуреакціюХеддлсона, особливопримасовихобстеженняхнабруцельоз. Дляцього добре знежирену скляну пластину8× 12 см розділяють восковим олівцем на 6 однакових квадратів. Нерозведену сироватку хворого і бруцельозний діагности-
![](/html/2706/380/html_BOh9no_zrM.2tbJ/htmlconvd-gM9GOT236x1.jpg)
236 |
Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія |
кум наносять за допомогою піпеток згідно з схемою (табл. 51). Краплі сироватки
іантигену змішують обережним похитуванням пластини або скляною паличкою, злегка підігрівають над полум’ям газового пальника. Максимальний строк спостереження8 хв. Припозитивнійреакціївзмішанихкрапляхпоявляютьсяпластівці, арідинастаєбільш-меншпрозорою. Аглютинаціявусіх4-охквадратахоцінюєть- ся як різко позитивна, в 3-й і 4-й дозах – позитивна, в 2-й дозі – слабко позитивна
ілише в дозі 0,8 мл – сумнівна. Відсутність аглютинації з усіма дозами сироваток
оцінюють як негативну реакцію.
Схема постановки пластинчастої реакції Хеддлсона |
Таблиця 51 |
||||||
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Компоненти, мл |
|
|
Номери квадратів |
|
|
||
1 |
2 |
3 |
4 |
|
5 КС |
6 КД |
|
|
|
||||||
Ізотонічний розчин Na Cl |
– |
– |
– |
– |
|
0,03 |
0,03 |
Сироватка хворого |
0,08 |
0,04 |
0,02 |
0,01 |
|
0,02 |
– |
Діагностикум |
0,03 |
0,03 |
0,03 |
0,03 |
|
– |
0,03 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму.
Для прискореної діагностики бруцельозу вживають також реакцію аглютинації бенгальського рожевого з кислим антигеном. Антиген готують із густої зависі бруцел, убитих нагріванням, з використанням буферного розчину (рН 3,6- 3,8) і барвника бенгальського рожевого. На скляну пластинку наносять 0,03 мл нерозведеної сироватки і 0,03 мл антигену, змішують їх круговим рухом скляної палички. Результат реакції враховують через 4 хв. Поява крупноабо дрібнозернистого аглютинату свідчить про позитивну реакцію.
Реакція зв’язування комплементу ставиться за звичайною схемою. Вона стає позитивною з 20-25-го дня захворювання й довго зберігається.
Постановку опсоно-фагоцитарної проби останнім часом проводять рідко. Натомість стали широко використовувати РНГА.
Реакція непрямої гемаглютинації при бруцельозі є специфічною і високочутливою. Дляїїпроведеннявикористовуютьеритроцитарнийбруцельознийполісахаридний діагностикум. Частіше РНГА ставлять у полістирилових прозорих планшетах із лунками (можна і в пробірках).
Досліджувану сироватку (а також завідомо позитивну і негативну для контролю) інактивують при температурі 56 оС протягом 30 хв. Для її серійного розведеннявикористовуютьнормальнусироваткукролика, заздалегідьрозведену1:100. Реакцію ставлять за такою схемою (табл. 52).
Реакція наступає через 1-2 год при кімнатній температурі. Облік її проводять через 2 год. Якщо гемаглютинація настає з розведенням сироватки 1:50 – реакція сумнівна; 1:100 і вище – позитивна.
Реакція Кумбса при бруцельозі також специфічна і високочутлива. Вона є цінним діагностичним тестом особливо при хронічних формах захворювання у людей і тварин.
![](/html/2706/380/html_BOh9no_zrM.2tbJ/htmlconvd-gM9GOT237x1.jpg)
Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань |
|
237 |
||||||||
|
|
Схема постановки РНГА |
|
|
Таблиця 52 |
|||||
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Компоненти, мл |
|
|
|
Номери лунок |
|
|
|
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
5 |
6 |
7 КС |
8 КД |
|
|
|
|
||||||||
|
Сироватка кролика 1:100 |
– |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
0,5 |
0,5 |
– |
0,5 |
|
Сироватка хворого 1:50 |
0,5 |
0,5 |
|
|
|
|
|
0,5 |
– |
|
Розведення сироватки |
1:50 |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
|
1:800 |
1:1600 |
1:50 |
– |
|
Діагностикум |
0,05 |
0,05 |
0,05 |
0,05 |
|
0,05 |
0,05 |
– |
0,05 |
Примітка: КС – контроль сироватки, КД – контроль діагностикуму
Алергічна проба Бюрне використовуєтся для діагностики бруцельозу, особливо при негативних бактеріологічних і серологічних дослідженнях. Пробу ставлять, починаючи з 15-20-го дня захворювання. У середній третині передпліччя внутрішньошкірновводять0,1 млбруцеліну(мелітину, абортину). Вінєпротеїновим екстрактом із культури бруцел. Позитивною реакцією вважають інфільтрат, почервоніння розміром 2× 3 см і більше, які виникають через 24-48 год. Алергічна проба буває позитивною після перенесеного захворювання, а також у щеплених. Це знижує діагностичну цінність проби Бюрне.
Сап і меліоїдоз
Сап – особливо небезпечна інфекційна хвороба, яка має гострий і хронічний септикопіємічний перебіг з утворенням пустул, виразок, абсцесів у тканинах і органах. Збудник – Pseudomonas mallei.
Джерелом інфекції є хворі коні, рідше віслюки, мули. Захворювання носить чітко виражений професійний характер. Найчастіше хворіють конюхи, їздові, ковалі, ветеринарні і зоотехнічні працівники. Шлях передачі – контактний, внаслідок попадання гною чи слизу від хворих тварин на шкіру або слизову оболонку, рідше – аліментарний, через воду. В Україні сап уже довго не реєструється, хоч можливе завезення хвороби з країн Африки, Азії та Середнього Сходу.
Матеріалом для мікробіологічної діагностики можуть бути гній, виділення з виразок, носоглотки, кон’юнктиви, харкотиння, кров, сеча, фекалії. Забір матеріалу і його дослідження проводять в умовах, необхідних для роботи із збудниками особливо небезпечних інфекцій.
Первинна бактеріоскопія має обмежене значення, оскільки досліджуваний матеріал сильно контаміновий сторонньою мікрофлорою, а характерних морфологічних ознак у збудника сапу немає (грамнегативні поліморфні, часом зернисті паличкибезджгутиківіспор). ЛишепривикористанніРІФможнаотриматипозитивні результати.
Дляпроведеннябактеріологічнихдослідженьзметоювиділеннячистоїкультурипатологічний матеріалсіютьнагліцериновийбульйоніагарабокартопляногліцериновий агар, до яких можна додавати пеніцилін чи бактеріостатичні барвникидляпригніченняростусторонньоїмікрофлори. Виділеннягемокультурипро-
238 |
Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія |
водять шляхом посіву 10 мл крові в 250 мл МПБ. У гліцериновому бульйоні паличка сапу викликає помутніння з утворенням пристінкової плівки, від якої вниз спускаються ниткоподібні утвори. На гліцериновому агарі при 37 °С через 18-20 год появляються плоскі напівпрозорі колонії, які, зливаючись, утворюють густі нальоти слизової маси янтарногокольору. Накартопляно-гліцериновомуагаріви- ростають ніжні напівпрозорі колонії, які через кілька днів утворюють наліт жов- то-бурого кольору, подібний до меду.
Колонії досліджують мікроскопічно, перевіряють на рухливість, відсівають на скошений агар для виділення чистої культури. Ідентифікацію збудника проводять на основі характерних культуральних і біохімічних властивостей та реакції аглютинації на склі специфічною діагностичною сироваткою. При неможливості виділитичистукультурувиявляютьантигенизбудникавдосліджуваномуматеріалі за допомогою постановки РНГА з еритроцитарним антитільним діагностикумом.
Дуже ефективним, але й небезпечним методом діагностики сапу є внутрішньоочеревиннезараженнясамцівгвінейськихсвинокабозолотистиххом’ячків. У тварин через 2-3 дні розвивається перитоніт і гнійний орхіт (феномен Штрауса). Важливо пам’ятати, що скротальний феномен можуть також викликати Pseudomonas aeruginosa і P. рseudomallei. Є й додаткові диференціальні ознаки збудника сапу: відсутність рухливості, росту при 42 оС і розрідження желатину.
Із серологічних методів діагностики сапу застосовують реакції аглютинації, зв’язування комплекту і непрямої гемаглютинації. РЗК є найбільш чутливою серологічною реакцією. Діагностичний титр її становить 1:20 і вище.
Важливим методом діагностики захворювання є постановка алергічної проби з малеїном. Він є основним тестом у ветеринарній практиці при розпізнаванні сапу у тварин. Препарат вводять у кон’юнктивальний мішок. У людей пробу з малеїном треба ставити обережно, оскільки можливе загострення хвороби. На внутрішнійповерхніпередпліччястроговнутрішньошкірновводять0,1 млмалеїну, розведеного 1:1000. У зв’язку з цим розроблено більш безпечний варіант постановки алергічної проби – введення малеїну на скарифіковану шкіру. Результати реакції враховують через 24 і 48 год.
Меліоїдоз – сапоподібне особливо небезпечне захворювання людини, диких і домашніх тварин. Збудником його є Pseudomonas pseudomallei. Хвороба реєструєтьсяпереважновкраїнахАзії, АвстраліїіКарибського регіону. Можливе завезення меліоїдозу із названих країн до нашої держави.
Джерелом інфекції в природі є дикі гризуни (щури, миші), домашні тварини (коти, собаки, корови, вівці, свині, коні), кенгуру. Воточуючесередовищезбудник потрапляє з сечею, випорожненнями, гнійними виділеннями з носоглотки й очей хворихтварин. Основниймеханізмпередачімеліоїдозу – контактний, рідше– аліметарний і ще рідше – аспіраційний або трансмісивний.
Матеріалом для мікробіологічної діагностики меліоїдозу служить гній, виділення з носоглотки, виразок, харкотиння, кров, сеча, випорожнення. Взяття матеріалу, йоготранспортуванняібактеріологічнедослідження проводятьізтакимиж пересторогами, як і при інших особливо небезпечних інфекціях.
Розділ 11. Мікробіологічна діагностика окремих інфекційних захворювань |
239 |
Лабораторна діагностика меліоїдозу грунтується на тих самих принципах, щойдослідження при сапі. Посіви матеріалу проводятьнакров’янийагарігліцеринові середовища з додаванням антибіотиків (неоміцин) і бактеріостатичних барвників. Найбільш характерними ознаками для ідентифікації збудника меліоїдозуєнаступні: біполярністьзабарвлення, складчастіколоніїізморшкуватаплівка на бульйоні, гемоліз на 2 % кров’яному агарі, рухливість, позитивна РІФ. Досить чутливим методом є постановка біологічної проби на гвінейських свинках і золотистих хом’ячках (скротальний феномен).
Серологічна діагностика меліоїдозу має лише допоміжне значення. Використовують реакції аглютинації (діагностичний титр 1:640 і більше), зв’язування комплементу (діагностичний титр 1:20 і вище) та РНГА.
Шкірнуалергічнупробузмеліоїдиномвикористовуютьлишеуветеринарній практиці.
Сибірка(злоякісний карбункул)
Сибірка – гостре особливо небезпечне інфекційне захворювання домашніх і диких тварин, від яких заражуються і люди шляхом прямого контакту з хворими тваринами та різноманітною сировиною. Виділяють шкірну, легеневу й кишечну форми хвороби.
Збудник сибірки – Bacillus anthracis – належить до роду Bacillus родини Bacillaceae. Рід Bacillus об’єднує ще декілька видів бацил, з якими необхідно диференціювати виділені культури сибіркових паличок. Найголовніші з них –
B.сereus,B. anthracoides, B. subtilis, B. megaterium.
Взяття матеріалу і відсилка проб. При проведенні лабораторної діагностики сибірки у людини досліджують різні матеріали залежно від клінічної форми захворювання: при шкірній формі – вміст везикул, карбункулів; при кишечній – випорожнення; легеневій – харкотиння. Кров досліджують при всіх клінічних формах. Від трупа беруть кров, шматочки паренхіматозних органів. Якщо негайно засіяти матеріал від трупа неможливо, з крові, пунктатів кісткового мозку і селезінки на предметних скельцях готують товсті мазки і висушують.
Всіпробивміщуютьусклянібанки, флакони, пробірки. Висушенімазкикладуть у чашки Петрі, обгортають вощаним або пергаментним папером, пакет надписують“Обережно, мазкинефіксовані!” Весьвідібранийматеріалретельновкладаютьуметалевийабодерев’янийящик, пломбуютьабоопечатуютьсургучем, на кришці пишуть “Верх, обережно!” Оформляють супровідний документ, у якому вказують який матеріал, місце і час забору, від кого взято, і нарочним негайно відправляють до спеціальної (режимної) лабораторії.
Розтин тварин, що загинули від сибірки, не проводять, оскільки це сприяє споруляції і розсіюванню збудника. При необхідності дозволяється брати лише вухо, його поміщають у банку, а місце розрізу припікають паяльною лампою або концентрованим розчином карболової кислоти. Беруть також взірці шкір, шерсті, вовни, щетини. Урядівипадківдосліджуютьхарчовіпродукти(м’ясо), воду, грунт.
![](/html/2706/380/html_BOh9no_zrM.2tbJ/htmlconvd-gM9GOT240x1.jpg)
240 Частина ІІІ. Спеціальна мікробіологія
Лабораторна діагностика сибірки складається із декількох етапів: бактеріоскопії мазків, виділення та ідентифікації чистої культури збудника, постановки біопроби, реакції термокільцепреципітації Асколі, постановки алергічної проби.
Бактеріоскопічний метод. Із крові, вмісту везикул, харкотиння виготовляютьпо4 мазки зкожноїпроби, забарвлюютьїхзаГрамом, Романовським-Гімзою, сибірковою люмінесцентною сироваткою, розчином Ребігера, який одночасно фіксуєізабарвлюєпрепарат. ІзрізнихспособіввиявленнякапсулметодРебігера є найпростішим і найдемонстративнішим (рис. 70). Беруть 15-20 г генціану фіолетового і розчиняють у 100 мл 40 % формаліну. Розчин витримують при кімнатній
температурі кілька годин, потім фільтрують. Не-
|
фіксований мазок забарвлюють 15-20 секунд, про- |
|
мивають, висушують. Тіло бацил забарвлюється в |
|
темно-фіолетовий, акапсули – вчервоно-фіолетовий |
|
колір, за Романовським-Гімзою – тіло клітин набу- |
|
ває голубого, а капсула – світло-рожевого кольору. |
|
Приобробці мазка флуоресцентноюсироваткою ба- |
|
цили сибірки під люмінесцентним мікроскопом ви- |
|
глядають як великі палички, що оточені яскраво- |
|
світлимзеленуватимобідком. Наявністьумазкахти- |
|
пових бацил, що розташовуються ланцюжками, |
Рис. 70. Капсули B.anthracis |
оточеними капсулами, дають специфічну флуорес- |
у мазку з селезінки. |
ценцію, обумовлює можливість поставити попе- |
редній діагноз сибірки.
Бактеріологічнеібіологічнедослідження. Остаточнийдіагнозсибіркимож-
на поставити лише після виділення чистої культури і позитивної біопроби на тваринах. Досліджуваний матеріал сіють у МПБ, чашки з МПА і кров’яним агаром. Посіви інкубують при температурі 37 °С протягом 18-20 год. Одночасно з посівами емульгованим дослідним матеріалом заражують підшкірно лабораторних тварин. Білим мишам його вводять біля кореня хвоста – 0,1 мл, гвінейським свинкам під шкіру живота – 0,2 мл, кроликам – 0,5-3,0 мл.
Убульйоніспостерігається рістувиглядіжмутка вати, примікроскопії якого видно типове розташування мікробів у вигляді довгих ланцюжків (стрептобацили). На поверхні МПА виростають великі шорсткі матові R-форми колоній з нерівним, волокнистим, кучерявим краєм (“голова медузи”, “левова грива”).
Такі колонії необхідно вивчати під малим збільшенняммікроскопаупрохідномусвітлі(рис. 71). Накро- в’яному агарі колонії мають S- або SM-форму без гемолізу, в той час як навкруги колоній антракоїдів виникає велика зона просвітлення середовища.
На МПА і МПБ B. anthracis при звичайних аеробних умовах росте без утворення капсул, що не Рис. 71. Колонія B. anthracis. дає змоги визначити одну з найважливіших її ознак.