Практическое занятие №13 Тема: "Серологические реакции с метками"

Термин

Определение

1

2

Реакция связывания комплемента

Многокомпонентная серологическая реакция, которая заключается во взаимодействии антигена с соответствующим специфическим антителом и образовании специфического комплекса антиген- антитело и связыванием комплемента.

1

2

Образовавшийся комплекс не вызывает никаких видимых изменений. Чтобы установить, состоялось ли связывание комплемента или он остался свободным (несвязанным), в реакцию вводят вторую систему (гемолитическую), которая в свою очередь состоит из антигена (3% взвесь эритроцитов) и специфической гемолитической сыворотки (взятой в утроенном титре). При отсутствии свободного активного комплемента гемолиз эритроцитов под действием специфического гемолизина не происходит (реакция позитивна). В случае несоответствия антитела и антигена в первой системе, комплемент остается свободным и в его присутствии наступает гемолиз второй системы (реакция негативна).

Моноклональные антитела (МКАТ)

Антитела, полученные с помощью гибридомных технологий. Принадлежат к одному классу иммуноглобулинов и реагируют со специфическим эпитопом антигена, против которого они выработались. В серологических реакциях с меткой использование МКАТ имеет целый ряд преимуществ по сравнению с поликлональными антителами, а именно: однородность, отсутствие неспецифических антител, простота распознавания и высокая воспроизводимость результатов.

Серологические реакции с метками

Реакции, основанные на выявлении образованного при взаимодействии антигена с антителом иммунного комплекса по метке, прикрепленной к одному из компонентов реакции, которая наблюдается или визуально, или с помощью специальных высокочувствительных приборов, позволяющих количественно выявить меченый субстрат и, соответственно, неизвестный антиген или антитело.

Метка

Для РИФ – светящийся в ультрафиолетовом свете краситель (изоционат флюоресцеина).

Для ИФА – фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза), выявляемый по изменению цвета соответствующего субстрата

Для РИА – изотоп, выявляемый с помощью радиометрии.

Реакция иммунофлюо-ресценции (РИФ)

Основана на свойстве флюоресцирующих антител специфически соединяться с гомологичным антигеном и светиться в фиолетовой и ультрафиолето

1

2

вой части спектра люминесцентного микроскопа. РИФ специфична, высокочувствительна, используется в основном для идентификации антигена и может быть осуществлена в нескольких вариантах.

1. Прямая РИФ – используются иммунофлуо-ресцирующие сыворотки против каждого исследуемого антигена.

2. Непрямая РИФ - основана на использовании двух разных сывороток. На первом этапе используют немеченые антитела против исследуемого антигена, а на втором этапе реакции образованный комплекс антиген-антитело обрабатывают флуоресцирующей сывороткой, которая содержит антитела против гамма-глобулинов того вида животных, от которых была получена специфическая немеченая сыворотка.

Имуноферментный анализ (ИФА)

Основан на использовании в качестве метки для антител ферментов, способных разлагать субстраты с образованием окрашенных продуктов. Используются как прямой, так и непрямой варианты ИФА. Суть его заключается в том, что сначала на каком-то твердом материале будут сорбировны антигены (или антитела), а потом добавлены все другие ингредиенты серологической реакции. Как твердофазные носители антигена или антител широко используются пластиковые планшеты, шарики, пленки, пробирки из разных синтетических материалов. Адсорбированные на поверхности таких материалов антигены или антитела даже в высушенном состоянии долгое время сохраняют свою иммунологическую специфичность и способность вступать в серологические реакции.

Наличие и активность фермента, связанного с антителом или комплексом антиген-антитело выявляют и оценивают визуально по интенсивности окраски после инкубации с соответствующим субстратом. ИФА проводится с помощью специального оборудования, в котором автоматически происходит промывка реагентов буфером (вошер) и результат регистрируется с помощью фотометра (ридер).

1

2

Радиоиммунный анализ

Радиоиммунный анализ (РИА) основан на использовании как метки одного из компонентов серологической реакции радиоактивных изотопов. Метод наиболее чувствителен и позволяет выявлять незначительные количества реагентов. Как и при постановке ИФА используют прямой и непрямой варианты. Для проведения РИА и регистрации результатов необходима специальная радиометрическая аппаратура.