MolBiol_sivolob

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

Ключову роль у виборі одного з двох шляхів виконують два фактори транскрипції: білок Cro і λ-репресор – продукти відповідно генів сro і сІ, що містяться поруч у фаговому геномі (рис. 5.18, 5.19). Відразу після інфекції РНК-полімераза зв'язується з двома сильними промоторами PR і PL (рис. 5.18), з яких відбувається транскрипція у протилежних напрямах на генах сro і N відповідно. Обидва гени закінчуються термінаторами, але щойно з'являється білок N, він зв'язується з транскриптами, рекрутує декілька бактеріальних білків, і цей комплекс запобігає впізнанню термінаторів (за механізмом антитермінації, див. рис. 5.16, а). РНК-полімераза в цьому випадку продовжує синтезувати поліцистронну мРНК на сІІІ і генах рекомбінації (із промотора PL) і сІІ, генах реплікації та Q (із промотора PR). Після цього можливе розгалуження на два альтернативні шляхи (рис. 5.20).

Розглянемо спочатку шлях лізогенії. Продукт гена сІІ – активатор транскрипції, який забезпечує зв'язування РНК-полімерази зі слабким промотором PRЕ. Із цього промотора (у напрямку, протилежному напрямку транскрипції сro, рис. 5.18) транскрибується ген сІ, унаслідок чого з'являється λ-репресор. Крім того, білок сІІ активує ген інтегрази (міститься серед генів рекомбінації) – ферменту, що забезпечує вбудовування фагової ДНК у геном клітини-хазяїна (див. розділ 10). Продукт гена сІІІ захищає білок сІІ від бактеріальних протеаз, тобто підвищує час життя активатора. Отже, за умови високої концентрації сІІ виникає певна кількість λ-репресора, а фагова ДНК вбудовується інтегразою в бактеріальний геном.

Репресор (гомодимер, N-кінцеві частини обох субодиниць взаємодіють з ДНК (див. рис. 3.12, 3.13, а)) має спорідненість до двох наборів операторів. Один із цих наборів – оператори OR 1,2,3, кожен довжиною 17 пар основ – частково перекриває промотори PR і PRM (рис. 5.19). Промотор PRM є слабким і може використовуватись для транскрипції гена сІ тільки за умови активації. Послідовності операторів є гомологічними одна одній і розрізняються за спорідненістю до репресора – найвищу спорідненість має ділянка OR 1.

При заповненні цього оператора репресором промотор PR гена сro та всіх генів праворуч від нього є заблокованим. С-кінцеві частини двох димерів репресора здатні до взаємодії: за наявності репресора в сайті OR 1 швидко заповнюється також сайт OR 2. Інакше кажучи, репресор кооперативно взаємодіє з ділянками OR 1,2: його зв'язування з ДНК підсилюється білок-білковими взаємодіями димерів. При заповненні оператора OR 2 репресор (який є негативним регулятором

153

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

гена cro) спрацьовує як позитивний регулятор свого власного гена сІ – індукує зв'язування РНК-полімерази з промотором PRM. Спорідненість репресора до оператора OR 3 є найнижчою: ця ділянка некооперативно заповнюється при зростанні концентрації репресора, унаслідок чого відбувається блокування гена сІ. Таким чином активність гена сІ і концентрація репресора підтримуються на оптимальному рівні за принципом зворотного зв'язку. На стадії лізогенії тільки ген сІ є активним – репресор блокує також промотор PL (через відповідні оператори ОL), тобто транскрипцію всіх генів ліворуч від N.

Рис. 5.19. Зона контакту між генами сІ і cro фага λ: промотори генів частково перекривають три оператори OR 1,2,3, кожен з яких має спорідненість до репресора та білка Cro

Якщо бактерія піддається дії мутагенів, коли виникає ризик загибелі клітини (разом із вбудованою фаговою ДНК), відбувається активація певної бактеріальної протеази, яка розрізає молекулу репресора між її N- та С-кінцевими доменами. Результатом є порушення димеризації мономерів репресора і втрата спорідненості до ДНК. Унаслідок звільнення операторів OR та OL РНК-полімераза зв'язується з промоторами PR та PL і починає транскрибувати гени cro та N. Тобто знову виникає ситуація, що спостерігається відразу після інфекції – спрацьовують гени реплікації, сІІ і Q. Але при цьому білок сІІ швидко деградується протеазами, не встигаючи активувати синтез репресора. Така сама ситуація (висока активність протеаз) може реалізуватися відразу після інфекції за умови збагачення середовища на харчові ресурси.

154

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

Ncro

Інтеграція cI

λ-репресор

Репресія cro та N

Рис. 5.20. Мережа регуляторних взаємодій між генами фага λ. Прямокутники – транскрипти, отримані з відповідних генів, овали – їхні білкові продукти

Білок Cro (також гомодимер) некооперативно взаємодіє з операторами OR 1,2,3, спорідненість до яких знижується в порядку 3–2–1. Заповнення OR 3 білком Cro остаточно вимикає синтез репресора з промотора PRM. Подальше заповнення операторів при зростанні концентрації Cro вимикає транскрипцію cro і генів праворуч від нього, так само як і генів ліворуч від N за рахунок зв'язування Cro з операторами OL. Але головний наслідок активності cro полягає в появі білка Q.

Ще один промотор PR' є насправді сильним, але відразу за ним розташований термінатор – РНК-полімераза за відсутності Q синтезує з цього промотора короткий нефункціональний транскрипт. Білок Q спрацьовує як антитермінатор (за механізмом, зображеним на рис. 5.16, б), забезпечуючи долання цього бар'єра. У результаті відбувається синтез поліцистронної мРНК на генах лізису та білків оболонки (праворуч від Q), і відбувається лізис клітини з виходом фагових частинок.

Розглянута досить складна система регуляції транскрипції порівняно простого геному бактеріофага λ дає уявлення про те, наскільки ускладнюється загальна система регуляції транскрипції у бактерій

155

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

і тим більше – в еукаріотів. Насправді ж складність загальних систем внутрішньоклітинної регуляції, які залежать від тонкого балансу великої кількості різноманітних впливів, залишається дуже далекою від остаточного розуміння.

Неспецифічна регуляція загального рівня транскрипції

Поряд із специфічною активацією / репресією окремих генів, у бактеріальній клітині здійснюється неспецифічна регуляція загального рівня транскрипційної активності. Принаймні два загальні механізми використовуються для такої регуляції. Перший пов'язаний з утворенням відкритого комплексу при ініціації транскрипції – необхідністю локального плавлення подвійної спіралі, яке, у свою чергу, полегшується негативною надспіралізацією ДНК (розділ 3). У результаті активність багатьох бактеріальних промоторів суттєво залежить від рівня негативної надспіралізації, який варіює в різних фазах клітинного циклу й визначається концентраціями бактеріальних топоізомераз.

3'

5'

Рис. 5.21. Схема вторинної структури 6S РНК,

яка може використовуватись як матриця для РНК-полімерази. Стрілочкою позначено початок синтезу

Другий загальний механізм регуляції використовує особливу молекулу РНК – так звану 6S РНК довжиною 184 нуклеотиди. Молекула РНК формує велику двоспіральну шпильку з кількома неспареними ділянками (рис. 5.21). Одна з неспарених ділянок містить близько 15 пар основ і нагадує транскрипційний міхур (порівн. з рис. 5.6) – саме вона сприймається РНК-полімеразою як промотор. Відбувається ефективне зв'язування, і якщо внаслідок пригнічення біохімічних синтезів (недостатності ресурсів) концентрація NTP є низькою, полімераза виявляється “заарештованою” і нездатною ініціювати транскрипцію на ДНК.

Для того, щоб звільнитися від 6S РНК, полімераза має розпочати “транскрипцію”, на цій РНК-матриці. Саме це й відбувається при підвищенні концентрації NTP (ДНК-залежна РНК-полімераза працює як

156

Розділ 5. Транскрипція: Прокаріоти

РНК-залежна): здійснюється елонгація транскрипції з руйнуванням подвійної спіралі РНК, синтез короткого нефункціонального транскрипту та звільнення ферменту, який далі шукає справжній промотор.

КОНТРОЛЬНІ ЗАПИТАННЯ

1.Як за своїм складом і спорідненістю до ДНК розрізняються кор-

іголофермент бактеріальної РНК-полімерази? Яке значення має ця різниця для ініціації транскрипції?

2.Яку будову має стандартний бактеріальний промотор?

3.Чим розрізняються закритий і відкритий комплекси РНКполімерази з промотором?

4.У якому напрямку здійснюється зчитування інформації з ДНК під час транскрипції? Що таке змістовний і антизмістовний ланцюги? Який з них є матричним?

5.Яку роль відіграє σ-фактор в ініціації транскрипції?

6.Як забезпечується висока процесивність РНК-полімерази?

7.Як організовано активний центр РНК-полімерази? Які сполуки

єсубстратами (будівним матеріалом) синтезу РНК?

8.Опишіть основні етапи елонгаційного циклу РНК-полімерази. Чому фермент рухається вздовж ДНК під час транскрипції?

9.Яким чином здійснюється при транскрипції редагування помилок приєднання нуклеотидів?

10.Як здійснюється термінація транскрипції у бактерій?

11.Яка різниця між цис- і транс-елементами системи регуляції транскрипції?

12.Опишіть систему регуляції лактозного оперона. Яку роль у регуляції відіграють lac-репресор і білок САР?

13.Що таке антитермінація?

14.Як здійснюється атенюація в триптофановому опероні?

15.За якими механізмами здійснюється регуляція загального рівня

транскрипції в бактеріальній клітині?

16. Охарактеризуйте стадії життєвого циклу бактеріофага λ. Як відбувається перемикання між різними шляхами розвитку?

17. Репресор бактеріофага λ є позитивним чи негативним регулятором транскрипції гена cro? Гена сІ?

157

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Пташне, М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг λ. – М.: Мир, 1988.

Busby, S., Ebright, R.H. Promoter structure, promoter recognition, and transcription activation in prokaryotes // Cell. – 1994. – Vol. 79.

– Р. 743–м746.

Ciampi, M.S. Rho-dependent terminators and transcription termination // Microbiology. – 2007. – Vol. 152. – Р. 2515–2528.

Greive, S.J., von Hippel, P.H. Thinking quantitatively about transcriptional regulation // Nature Rev. – 2005. – Vol. 6. – Р. 221–232.

Lane, W.J., Darst, S.A. The structural basis for promoter – 35 element recognition by the group IV σ factors // PLoS Biol. – 2006. – Vol. 4(9).

– Р. e269 (www.plosbiology.org).

Steitz, T.A. Visualizing polynucleotide polymerase machines at work // EMBO J. – 2006. – Vol. 25. – Р. 3458–3468.

Wassarman, K.M., Saecker, R.M. Synthesis-mediated release of a small RNA inhibitor of RNA polymerase // Science. – 2006. – Vol. 314.

– Р. 1601–1603.

Willenbrock, H., Ussery, D.W. Chromatin architecture and gene expression in Escherichia coli. //Genome Biology. – 2004. – Vol. 5.

– Р. 252 (http://genomebiology.com/2004/5/12/252).

Wilson, C.J., Zhan, H., Swint-Kruse, L., Matthews, K.S. The lactose repressor system: paradigms for regulation, allosteric behavior and protein folding // Cell Mol. Life Sci. – 2007. – Vol. 64. – Р. 3–16.

Young, B.A., Gruber, T.M., Gross, C.A. Views of transcription initiation //Cell. – 2002. – Vol. 109. – Р. 417–420.

158

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

РНК-полімераза II

Структура РНК-полімерази ІІ

РНК-полімераза ІІ, яка відповідає за синтез мРНК, складається з 12 субодиниць (рис. 6.1). Найбільша субодиниця (гомолог субодиниці β' прокаріотичної полімерази) формує, зокрема, активний центр, структура і найближче оточення якого є практично ідентичними таким бактеріальної полімерази (розділ 5).

F-спіраль

РНК

Матричний ланцюг

Нематричний

ланцюг

Рис. 6.1. Структура елонгаційного комплексу РНК-полімерази ІІ (1R9T)

Відповідно, ідентичними є й механізми елонгації синтезу РНК. На рис. 6.2 показано структуру оточення активного центру на різних стадіях елонгаційного циклу (порівн. з рис. 5.3, 5.10): вхід NTP через вторинний канал; зв'язування NTP з матрицею та його фіксація в активному центрі завдяки двом іонам Mg2+, які утримуються трьома залишками Asp; каталіз реакції приєднання нуклеотиду до 3'-кінця транскрипту; транслокація полімерази на один нуклеотид уздовж матриці, унаслідок чого система здатна вступити в новий цикл елонгації.

Під час елонгації, так само як і для бактеріальної полімерази, за умови нестабільності РНК-ДНК гібрида на 3'-кінці можливий зворотний рух полімерази з виходом 3'-кінця транскрипту у вторинний канал. У цьому випадку взаємодія з фактором транскрипції TFIIS

160

Розділ 6. Транскрипція: Еукаріоти

(Transcription Factor S of RNA-polymerase II, аналог бактеріальних фак-

торів GreA/B) індукує нуклеазну активність, яка забезпечує редагування помилок при транскрипції (див. розділ 5).

Особливістю РНК-полімерази ІІ (характерною тільки для цієї полімерази) є наявність у найбільшої субодиниці С-кінцевого домену – CTD (C-Terminal Domain). CTD – це довгий невпорядкований хвіст (не показаний на рис. 6.1), амінокислотна послідовність якого є гептапептидом

Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser, що тандемно повторюється 52 рази. Три залишки Ser у складі гептапептиду є субстратами фосфорилювання / дефосфорилювання для специфічних кіназ і фосфатаз. CTD, який відходить від полімерази поблизу від каналу виходу мРНК, є платформою для зв'язування численних білків, спорідненість яких залежить від патерна фосфорилювання. Зокрема, CTD відіграє ключову роль у перемиканні між ініціацією та елонгацією транскрипції (див. нижче) та у збиранні елементів системи процесингу мРНК (розділ 7) під час елонгації.

Mg++ NTP

г в

Рис. 6.2. Стадії елонгаційного циклу РНК-полімерази ІІ:

(а) – вхід NTP до активного центру (1R9T); (б) – впізнання матриці

та зв'язування NTP (1R9S); (в) – претранслокаційний стан після приєднання нуклеотиду до транскрипту (1I6H); (г) – посттранслокаційний стан (1SFO)

161

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Для ініціації транскрипції є необхідним збирання на промоторі

преініціаторного комплексу (PIC – Pre-Initiation Complex) за участю при-

наймні 12-субодиничної РНК-полімерази ІІ та шести базальних (загаль-

них) факторів транскрипції TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH.

Промотор РНК-полімерази ІІ

Промотор РНК-полімерази ІІ, узагальнену схему якого зображено на рис. 6.3, може складатися з наступних елементів послідовності (для конкретних промоторів спостерігаються численні варіації цієї схеми). Проксимальні (приблизно в зоні –50 …–200 пар основ відносно старту транскрипції) та дистальні (будь-де відносно старту) регуляторні елементи мають спорідненість до специфічних факторів транскрипції, взаємодія з якими активує / блокує збирання преініціаторного комплексу. Якщо дистальний елемент підсилює ефективність ініціації, його називають енхансером (enhancer – підсилювач), якщо навпаки – сайленсером (silencer – глушник). У зоні старту знаходиться так званий базальний промотор, на якому, власне, і відбувається збирання PIC.

Рис. 6.3. Приблизна узагальнена схема організації промотора РНК-полімерази ІІ і консенсусні послідовності основних елементів базального промотора

Базальний промотор може включати (не обов'язково) три елементи: ТАТА-бокс (починається приблизно з –30-ї пари основ), ініціаторний елемент (Initiator, Inr) безпосередньо в зоні старту, DPE (Downstream Promoter Element) на відстані приблизно +30 пар основ від старту.

162