Genetics_sivolob_et_al

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

Репарація дволанцюгових розривів

Точна репарація дволанцюгового розриву ДНК можлива лише під час або відразу після реплікації, коли розірвана ділянка може бути відновлена завдяки використання сестринської молекули як матриці за механізмом гомологічної рекомбінації (див. нижче).

В інших випадках цілісність розірваних молекул ДНК відновлюється в консервативному для всіх організмів процесі, який назива-

ється негомологічним з'єднанням кінців (NHEJ – Non-Homologous End Joining, рис. 1.25). З'єднуються при цьому будь-які кінці ДНК, що, за наявності великої кількості розривів, приводить до об'єднання ділянок різних хромосом – хромосомних перебудов (розділ 4).

Білки Ku

Рис. 1.25. Негомологічне з'єднання кінців ДНК

Ключову роль у процесі NHEJ відіграють білки Ku, які розпізнають кінці ДНК, об'єднують їх у нековалентний комплекс і рекрутують до нього низку інших білків. У складі комплексу відбувається розплітання кінцевих ділянок ДНК і пошук мікрогомології – коротких комплементарних (чи майже комплементарних) одноланцюгових ділянок, котрі належать різним молекулам. У результаті утворюється короткий дуплекс, зайві одноланцюгові ділянки відщеплюються нуклеазами, лігаза зшиває одноланцюгові розриви. Таким чином, у процесі з'єднання відбувається втрата кількох пар основ.

41

Генетика

ГОМОЛОГІЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ ДНК

Суттєвим моментом існування ДНК у живих системах є не тільки процеси відновлення та збереження інформації, яка міститься в послідовності нуклеотидів, а й різноманітні дії, спрямовані на перетасування цієї інформації з метою створення нових комбінацій генів. Найважливішою серед подібних операцій є гомологічна рекомбінація – обмін ділянками між досить довгими молекулами ДНК із гомологічними послідовностями пар основ. Такий процес відбувається в усіх організмів, котрі розмножуються статевим шляхом, між гомологічними хромосомами при мейозі (у процесі утворення статевих клітин). Також гомологічна рекомбінація можлива в парах гомологічних дочірніх молекул ДНК при реплікації в соматичних клітинах (мітотична рекомбінація) і в прокаріотів, скажімо, після кон'югації двох бактеріальних клітин і проникнення ДНК із однієї в іншу (див. розділ 5).

Необхідною умовою для здійснення гомологічної рекомбінації є гомологія послідовностей між двома молекулами ДНК по всій довжині. Загальну модель початкового етапу гомологічної рекомбінації зображено на рис. 1.26. Ініціюючою подією є дволанцюговий розріз в одній із гомологічних молекул (здійснюється спеціальними ферментами). Цей розріз за рахунок активності комплексу білків recBCD (тут і далі вказано назви білків, які забезпечують гомологічну рекомбінацію в E. coli, гомологічні білки є також і в еукаріотів) "розширюється" шляхом 5'-екзонуклеазної деградації ДНК – у результаті в місці розрізу залишаються два одноланцюгові 3'-хвости. Один із них (у комплексі з білком recA) здійснює інвазію – утворює подвійну спіраль з антипаралельним ланцюгом інтактної гомологічної молекули ДНК. Інший ланцюг цієї останньої виштовхується з дуплексу у вигляді одноланцюгової D-петлі (від displacement). Разом із 3'-хвостом D-петля здатна переміщуватись у пошуку гомології – максимальної комплементарності в межах подвійної спіралі, яка утворилася між ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК. На наступному кроці відбувається репараційний синтез ДНК: два 3'-кінці розірваної молекули ДНК подовжуються ДНК-полімеразами з використанням як матриць двох ланцюгів інтактної молекули. До цього моменту схема на рис. 1.26 є од-

ночасно схемою точної репарації дволанцюгового розриву в одній із двох сестринських молекул ДНК під час реплікації.

42

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

Рис. 1.26. Початкові стадії гомологічної рекомбінації

Під час рекомбінації відновлення цілісності ДНК є тільки завершенням початкового етапу. У результаті інвазії та репараційного синтезу дві молекули ДНК об'єднуються, утворюючи два перехрещення ланцюгів – дві структури Холідея (Robin Holliday). Кожна така структура може переміщуватись (так звана міграція гілки), результатом чого є подовження гетеродуплекса – подвійної спіралі між двома майже комплементарними ланцюгами двох гомологічних молекул ДНК.

Розглянемо окрему одну структуру Холідея. Як видно з рис. 1.27, її можна піддати ізомеризації, повернувши два дволанцюгові кінці на 180°. Саме у формі без перехрещення ланцюгів (праворуч на рисунку) структура Холідея фіксується завдяки її взаємодії з білком ruvA: білок зв'язується з центром хреста, утримуючи чотири одноланцюгові ділянки у приблизно планарній квадратній конфігурації. З ruvA та двома дуплексами, що виходять із хреста в протилежних напрямках, взаємодіють два гексамерні білкові комплекси ruvВ, які

43

Генетика

в АТР-залежному процесі забезпечують протягування ланцюгів через комплекс ruvА / ruvВ – міграцію гілки з одночасним подовженням гетеродуплекса.

Рис. 1.27. Ізомеризація структури Холідея

Останньою подією рекомбінації є розділення (resolution) структури Холідея резольвазою – білком ruvС. Резольваза – це ендонукле-

(є два рівноймовірні варіанти такого зв'язування). Отже, резольваза робить дволанцюговий розріз через хрест двома можливими шляхами (рис. 1.28). Після наступного зшивання розривів лігазою залишаються дві дволанцюгові молекули ДНК.

На рис. 1.28 зображено ізомеризовану чотириланцюгову структуру з рис. 1.26 – дві структури Холідея з перехрещеннями перетворені на планарні (ділянки, які синтезовані шляхом репарації, не позначено) – і результат її розділення. Із чотирьох можливих комбінацій розділення двох структур Холідея показано дві. Одна з них приводить до рекомбінації (аналогічно, рекомбінантною є і пара розрізів 2 + 4): дві гомологічні молекули ДНК обмінялися ділянками, і умовна "абетка", якою позначено фрагменти ДНК, змінює регістр – великі літери замінюються на маленькі та навпаки. У масштабі цілих хромосом результатом рекомбінації є дві молекули, показані в центральній частині рис. 1.29. Пари розрізів 1 + 4 і 2 + 3 не приводять до рекомбінації. Отже, рекомбінація при розділенні структур Холідея відбувається з імовірністю 50 %.

44

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

Рис. 1.28. Схема розділення двох структур Холідея. Конфігурація чотирьох ланцюгів зверху є еквівалентною конфігурації на нижній панелі рис. 1.26.

Літерами позначено ділянки ланцюгів (великі й маленькі літери відповідають гомологічним ділянкам двох молекул, літери зі штрихом і без – комплементарним ділянкам вихідних дуплексів). Цифрами 1–4 позначено можливі розрізи резольвазою. Унизу: дві пари дволанцюгових молекул після розділення структур Холідея, отримані в результаті відповідних розрізів

Незалежно від того, чи відбулася рекомбінація, усі продукти містять гетеродуплекси (середня частина всіх кінцевих молекул на рис. 1.28). Оскільки гетеродуплекси складаються з майже комплементарних ланцюгів, вони містять місметчі. Відповідно, кінцевою операцією, яка завершує процес гомологічної рекомбінації, є репарація цих місметчів описаною вище системою mutHLSU. На відміну від того, як ця система спрацьовує після реплікації, після рекомбінації ланцюг, де відбувається заміна нуклеотидів, обирається випадково, наприклад, центральний фрагмент першої молекули на рис. 1.28 перетворюється або на В/В', або на b/b'. Якщо на цій ділянці розта-

45

Генетика

шований ген, шляхом репарації обирається один із його алелів – В чи b. Отже, ефектом рекомбінації може бути явище конверсії гена – заміни одного алеля на інший.

Кросинговер Подвійний кросинговер

Рис. 1.29. Кросинговер як результат рекомбінації двох дволанцюгових молекул ДНК

Іншим наслідком рекомбінації є обмін ділянками між двома гомологічними хромосомами – кросинговер (рис. 1.29). Під час процесу рекомбінації кросинговер між двома хромосомами може відбутися (і часто відбувається) у кількох точках (рис. 1.29). Зрозуміло, що чим більшою є відстань між двома хромосомними локусами, із тим вищою ймовірністю відбудеться обмін ділянками десь між цими локусами, і тим більшою буде кількість таких обмінів. Два локуси, що рознесені по хромосомі на велику відстань, починають поводити себе як незалежні (не зв'язані в одній хромосомі) спадкові елементи. У цьому, власне, і полягає біологічне значення гомологічної рекомбінації (детальніше ефекти кросинговеру описано в розділі 3.)

Серед інших процесів рекомбінації ДНК розрізняють сайтспецифічну рекомбінацію (вирізання / вбудовування однієї молекули ДНК з / в іншу за рахунок розпізнання специфічними білками коротких елементів послідовності ДНК, див. розділ 5), незаконну рекомбінацію (об'єднання двох молекул ДНК, які не мають ані гомології, ані специфічних елементів послідовності – основним механізмом є розглянуте вище негомологічне з'єднання кінців) і переміщення в межах геному мобільних елементів послідовності ДНК (розділ 6).

46

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

КЛІТИННИЙ ЦИКЛ І КЛІТИННИЙ ПОДІЛ В ЕУКАРІОТІВ

Реплікація ДНК відбувається під час так званої S-фази клітинного циклу, яка, у свою чергу, є одним з етапів інтерфази – періоду, коли хромосоми існують у вигляді хроматинових фібрил, і в клітині відбувається експресія генетичної інформації (рис. 1.30). Після закінчення реплікації та репараційних процесів, які її супроводжують, сестринські хроматиди (майбутні дочірні хромосоми), що утворюються внаслідок подвоєння ДНК, за рахунок взаємодії зі специфічними білками залишаються з'єднаними між собою. Клітина при цьому вступає у фазу G2, яку можна розглядати як підготовку до мітозу – клітинного поділу соматичних клітин.

Реплікація ДНК

S

G2

G1

Мітоз

Профаза

Рис. 1.30. Схема клітинного циклу

На першій стадії мітозу – у профазі – відбувається конденсація хроматид, а також дозрівання двох центросом (структур, що складаються з двох центріолей кожна), формування веретена поділу та приєднання ниток веретена до хромосом (рис. 1.31). Наприкінці профази центросоми розходяться до полюсів клітини.

47

Генетика

Анафаза

Метафаза

центромера

сестринські

хроматиди

Рис. 1.31. Схема клітинного поділу шляхом мітозу. Показано дві пари гомологічних хромосом

Далі в метафазі хромосоми (пари сестринських хроматид, з'єднаних між собою своїми центромерами) вишукуються по екватору клітини. Анафаза починається з роз'єднання центромер, після чого сестринські хроматиди, які тепер уже називаються дочірніми хромосомами, рухаються до полюсів. Під час телофази починається формування ядерних мембран і деконденсація хромосом. Закінчується телофаза (і сам мітоз) цитокінезом – розділенням двох дочірніх клітин.

По закінченні мітозу клітина, що буде ділитися далі, вступає у фазу G1 клітинного циклу (її можна розглядати як пререплікативну), а остаточно диференційована клітина, для якої цей мітоз став останнім, – у фазу G0 (рис. 1.30). Результатом мітозу є дві ідентичні клітини з двома ідентичними диплоїдними наборами хромосом.

При утворенні статевих клітин (гамет) шляхом мейозу в диплоїдній клітині-попереднику також відбувається реплікація ДНК і подвоєння хроматид, які залишаються зв'язаними своїми центромерами.

Мейоз здійснюється шляхом двох клітинних поділів (рис. 1.32). У профазі І (у ній розрізняють стадії лептотени, зиготени, пахітени, диплотени й діакінезу – на рисунку вони детально не показані) відбувається утворення так званих бівалентів, або тетрад, – комплексів гомологічних пар хроматид. Дві з чотирьох хроматид бівалента,

48

Розділ 1. Природа генетичного матеріалу

що належать гомологічним хромосомам, у кількох точках утворюють за участю певних білків синаптонемні комплекси, де починається процес гомологічної рекомбінації (рис. 1.32). У результаті частина гомологічних хромосом обмінюється своїми ділянками. Далі здійснюється поступова конденсація хроматид, і під мікроскопом можна побачити характерні перехрещення між хроматидами – хіазми, що утворилися внаслідок рекомбінації. Профаза І закінчується розділенням конденсованих бівалентів. Далі в метафазі І пари хроматид вишукуються по екватору, в анафазі І відбувається їхнє розходження, у телофазі І – остаточне розділення двох клітин, що містять подвійний набір молекул ДНК. Сестринські хроматиди при цьому залишаються з'єднаними в зоні своїх центромер.

Профаза І

Другий поділ

Метафаза І Анафаза І

Телофаза І

Рис. 1.32. Схема клітинного поділу шляхом мейозу. Показано одну пару гомологічних хромосом

Далі в другому поділі (профаза ІІ, метафаза ІІ, анафаза ІІ, телофаза ІІ на рис. 1.32 не показані) відбувається розділення центромер, розходження хромосом і поділ обох клітин – у результаті утворюються чотири гаплоїдні гамети. При заплідненні батьківські набори хромосом об'єднуються з утворенням диплоїдної зиготи, яка шляхом мітотичного поділу дає початок усім іншим клітинам багатоклітинного організму-нащадка.

49

Генетика

БАЗОВІ ЗАКОНОМІРНОСТІ СПАДКУВАННЯ

Наведений вище огляд молекулярних і цитологічних основ організації спадкового апарату дозволяє сформулювати кілька загальних правил спадкування генів:

•гени є ділянками ДНК, які несуть інформацію про структуру білків і таких молекул РНК, котрі безпосередньо виконують певні функції;

•сукупність білків (головним чином) визначає всі фізіологічні й зовнішні ознаки організму, тобто вияв певної ознаки залежить від певної сукупності генів;

•гени містяться у хромосомах – білково-нуклеїнових комплексах, у кожний із яких входить одна довга молекула ДНК;

•при розмноженні одноклітинних організмів нестатевим шляхом і поділі соматичних клітин багатоклітинного організму дочірні клітини отримують повний набір генів від материнської клітини в незмінному вигляді.

Решта правил стосується багатоклітинних еукаріотів, які розмножуються статевим шляхом:

•у кожній клітині багатоклітинного організму існує набір пар гомологічних хромосом (диплоїдний набір); у даній ділянці (локусі) кожної з хромосом певної пари можуть міститися ідентичні гени або різні варіанти одного гена (алелі).

•при утворенні гамет кожна з них отримує тільки одну хромосому з кожної пари, але перед цим гомологічні хромосоми обмінюються своїми ділянками;

•нащадок одержує по одному набору хромосом (і, відповідно, по одному набору алелів) від кожного з батьків.

Хоча більшість ознак залежить від активності певної сукупності генів, є випадки (їх меншість, але все одно досить багато), коли прояву зовнішньої ознаки можна поставити у відповідність лише один ген. Розглянемо на простому прикладі, як реалізуються сформульовані вище правила.

Забарвлення насіння гороху залежить від гена sgr, що кодує білок SGR (гени прийнято позначати, як правило, маленькими літерами, виділяючи їх курсивом, їхні продукти – великими; наведене позначення походить від "stay green"). Білок бере участь у процесі руйнування хлорофілу, унаслідок чого зріле насіння набуває жовтого кольору (стають видимими жовті пігменти каротиноїди). Мутація в гені sgr приводить до того, що насіння зберігає зелений колір. Отже, маємо два алеля одного гена,

50