Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Методика лабораторного культивирования аэробных микроорганизмов и определение энергетических параметров микробного роста. Учебное пособие
.pdf
3 РАСЧЕТ СТЕХИОМЕТРИИ ПРОЦЕССА
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
При разработке настоящей методики приняты следующие
допущения:
1. Метаболическая система клетки находится в
стационарных условиях, т.е. величина пулов макроэргических
соединений не меняется.
2. Скольжением в цепи окислительного
фосфорилирования можно пренебречь.
3. Распределение потоков энергии в живой клетке может
быть оценено в соответствии с общепринятым постулатом
Стоутхамера-Пирта об аддитивности затрат на поддержание
жизнедеятельности и рост клетки.
Вследствие того, что культивирование
4.
микроорганизмов с целью получения продукции микробного
синтеза проводится практически в постоянных физикохимических условиях, можно считать производство энергии в
клетке зависящим лишь от внутреннего биохимического
механизма преобразования молекулы субстрата; влиянием на
указанный процесс незначительного изменения внешних
условий можно пренебречь.
5. Жидкая фаза в лабораторном биореакторе
рассматривается как гомогенная среда; различием между
внутри- и внеклеточными концентрациями веществ
пренебрегаем.
6. Режим потока в лабораторном биореакторе близок к
идеальному перемешиванию (концентрации веществ в любой
точке рабочего объема одинаковы).
В качестве энергетического обмена аэробных
гетеротрофов условно принято выделять совокупность
процессов, приводящих в итоге к полному окислению
50
органического субстрата до углекислого газа и воды. Однако,
производство энергии в клетке может осуществляться и за счет
продуктного обмена – трансформации субстрата до
экзометаболитов.
Перестройка молекулы субстрата, взятая условно сама по
себе в отрыве от энергетического обеспечения, до уровня
сложности биологических полимеров, составляющих
микробную массу, отнесена в соответствии с общепринятыми
биофизическими подходами к пластическому обмену.
Под конструктивным обменом будем понимать
совокупность процессов пластического обмена и части
энергетических процессов, обеспечивающих энергией
протекание биосинтеза.
Стехиометрия процесса роста микроорганизмов
3.1
Материальный баланс процесса роста микроорганизмов
может быть представлен системой уравнений образования и
расхода макроэргических соединений (например,
пересчитанных на АТФ). Метаболические блоки представляют
собой совокупность биохимических реакций, сбалансированных
по всем веществам, кроме носителей энергии. Эти блоки удачно
названы парциальными обменами И.Г. Минкевичем и В.К.
Ерошиным [3]. К ним относятся: преобразование субстрата в
биомассу (пластический обмен), в органический продукт
(продуктный обмен), полное окисление органического субстрата
(энергетический или дыхательный обмен).
Существенное упрощение формы записи
стехиометрических соотношений может быть получено при
приведении (пересчете) формул всех углеродсодержащих
веществ (составов) к одному атому углерода.
51
Уравнение энергетического обмена представим в виде:
=
=
⋅=⋅
+⋅=⋅+
⋅
⋅−+=⋅−+⋅=
βββ
β
()(
)
⋅==⋅=
=
ββγββ
АДФOOCH
ββ
OrqS
ββ
HC
211
+⋅+⋅
2121
→+⋅+⋅
(3.1)
АТФOHCO
где: АТФ – пересчитанное на число молей АТФ суммарное
количество энергии, запасаемое в клетках в форме МЭС и
трансмембранного потенциала и доступное для последующего
использования в биохимических процессах.
Запишем уравнения поэлементного баланса для атомов
углерода, водорода и кислорода с учетом образования ES молей
АТФ при окислении 1 моля субстрата:
С:
H:
O:
Откуда:
Поскольку γ
β 1
= (4 · p + q – 2 · r) / p, получаем следующие
S
/Eβ
SC1S1
ββq
2
H1S1
22
ββββr
H1C1O1S1
)2/()2/2(2/)2(
Erqr
1111 SSHCO
.
выражения для стехиометрических коэффициентов:
EqEEE
1111
2/,/1,4/,/1
SHSCSSOSS
Пластический обмен (преобразование вещества
субстрата в биополимеры клетки без учета затрат
дополнительной энергии), может быть описан уравнением:
АТФENHOOCH
βββ
АДФEOHONCH
β
22
⋅+⋅+
XHdcb
XNOrqS
32222
→⋅+⋅+⋅+⋅
(3.2)
Выразим затраты кислорода через разность степеней
восстановленности субстрата и биомассы. Для этого запишем
уравнения элементного баланса по углероду, водороду,
кислороду и азоту:
52
С:
⋅+=⋅+
⋅
β
+=⋅+⋅
2
H
−⋅+
=
−−⋅++
=
−⋅+⋅+⋅−
=
⋅−⋅−+−⋅−+=−
γ
γ
−⋅+⋅+⋅−
()(
)
()()(
)
[
]
→⋅+⋅−+⋅⋅+⋅+
)
H:
O:
N:
N=2
2=S
23
βbββq
222
HNS
2
cβ
dββr
222
HOS
1
β
Тогда, из уравнения баланса числа атомов водорода,
подстановкой значений стехиометрических коэффициентов
1
β
и
2=S
N=2
cβ
получаем: 2/)3(
bcqβ
и далее из
баланса числа атомов кислорода следует:
2/]2/)3([
rbcqdβ
2
O
2
O
, или
4/)322(
bcdrqβ
.
Поскольку
)234()24( dcbrq
XS
bcdrq
322 ,
=
то получаем:
2/3;;4/;1
bcqc
ββγγββ
2222
HNXSOS
−⋅+==−==
.
Конструктивный обмен (синтез биомассы) может быть
описан путем энергетического сопряжения уравнения
образования макроэргических соединений (3.1) и их расхода в
процессе биосинтеза, пропорционального образованию новой
биомассы в соответствии с уравнением (3.2). Соответственно
сказанному, сложим уравнения (3.1) и (3.2):
4/γγ4/γ1/
XSSSXrqSX
( ) ( ) ( )
[ ]
SXSXdcb
NHcOEEOCHEE
32
(3.3
OHbcqEqECOEEONCH
2/32//
⋅−⋅++⋅⋅+⋅+
22
Продуктным обменом (синтезом органических
экзометаболитов) в условиях нелимитированного роста
биомассы микроорганизмов можно пренебречь. Именно такие
условия характерны для процессов производства микробного
53
белка, наработки посевных культур дрожжей и бактерий в
аэробных условиях. Но при проведении реальных процессов это
условие необходимо каждый раз проверять.
3.2 Энерго-материальный баланс процесса роста
аэробных микроорганизмов
Процесс роста микроорганизмов в аэробных условиях
при отсутствии значительного образования вторичных
метаболитов может иметь место только при полной
обеспеченности кислородом. В этом случае недоокисленные
продукты не накапливаются в клетке в избыточных количествах
и, соответственно, не выбрасываются в окружающую среду.
Однако, реализация такого процесса в отдельных случаях
встречает определенные трудности. При очень высокой
концентрации биомассы (выше 70 гАСБ/л), когда пузырьки газа
экранируются несколькими слоями клеток, остающиеся в ядре
потока культуральной жидкости клетки могут испытывать
кислородное голодание. Это может иметь место даже в том
случае, когда датчик растворенного кислорода выдает отличное
от нуля значение. Дело в том, что датчик растворенного
кислорода омывается потоком газожидкостной среды, и
мембрана датчика периодически контактирует с газовыми
пузырьками. Поэтому показания датчика, погруженного в
необезгаженную культуральную жидкость, не соответствуют
действительной концентрации кислорода в ядре потока.
Другой причиной, затрудняющей в некоторых случаях
реализацию высокоинтенсивного нелимитированного нехваткой
кислорода процесса, является синергический
(взаимоусиливающий) характер совместного ингибирующего
действия высоких концентраций субстрата и кислорода.
Особенно этот эффект выражен при использовании в качестве
54
субстратов спиртов и альдегидов, относительно концентраций
t
d
моль
которых диапазоны толерантности большинства
микроорганизмов довольно узки.
Тем не менее, в определенном диапазоне концентраций
биомассы, субстрата и растворенного кислорода, процессы
роста, не осложненные образованием недоокисленных
продуктов, вполне возможны и даже обычны. Такие процессы
описываются совокупностью стехиометрических уравнений
(3.1) и (3.3). Рассмотрим выражения метаболических скоростей
для данного случая.
Затраты субстрата – источника углерода и энергии –
можно представить как сумму затрат на поддержание
жизнедеятельности )(
пластическом обмене )(
l
R , н
S
R и на обеспечение дополнительной
энергией пластического обмена )(
а синтез клеточного тела в
x
S
c
R . При этом в соответствии с
S
уравнением (3.3) можно записать затраты субстрата в
c
x
конструктивном обмене:
c
d
VR +=⋅=
L
S
l
S
RR
S
k
S
k
(3.4)
S
RRR += . Тогда:
S
S
В соответствии с уравнением (3.1):
l
β
S
1 SXSLXSLS
)/(/
EMMVxeMMVxeR ⋅⋅⋅⋅=⋅⋅⋅⋅=
(3.5)
Правильность записи этого и подобных выражений можно
проверить подстановкой размерностей величин:
е
x VL MS MX E
моль АТФ
моль АСБ · час
г АСБ
л
л г S/моль S
г АСБ/моль
АСБ
55
S
моль
АТФ/
S
После сокращений получаем требуемую размерность
абсолютных затрат субстрата на поддержание
жизнедеятельности популяции - [г S/час].
В соответствии с уравнением (3.3):
k
S
µ
MMVxEER /)1/( ⋅⋅⋅⋅+=
(3.6)
XSLSX
В итоге, подставляя (3.5) и (3.6) в (3.4), получаем
следующее уравнение для метаболической скорости
потребления субстрата:
R ⋅⋅⋅
S
e
E
S
E
++=
1
E
X
S
M
⋅
µ
S
M
X
(3.7)
Vx
L
Затраты кислорода также можно представить как
сумму затрат на поддержание жизнедеятельности )(
синтез клеточного тела в пластическом обмене )(
l
R , на
O
x
R и на
O
обеспечение дополнительной энергией пластического обмена
c
)(
R :
O
k
l
c
x
l
O
O
O
O
RRRRRR +=++= (3.8)
O
O
В соответствии с уравнением (3.1):
l
β
O
1
γ
/
MMVxeR
=⋅⋅⋅⋅=
XOLO
(3.9)
)4/(
EMMVxe
⋅⋅⋅⋅⋅⋅
SXOLS
В соответствии с уравнением (3.3):
E
k
R /
=
O
⋅
XS
+
E
⋅
S
−
γγγ
XS
µ
44
⋅⋅⋅⋅
MMVx
(3.10)
XOL
56
Суммируя выражения (3.9) и (3.10) получаем следующее
уравнение для метаболической скорости потребления
кислорода:
e
R ⋅⋅
=
O
E
Скорость продуцирования углекислого газа можно
⋅
γ
S
S
1
S
E
X
+⋅+
−
E
S
⋅
X
M
µγγ
O
⋅
M
⋅
4
Vx
(3.11)
X
L
представить как продуцирование в процессе затрат субстрата на
поддержание жизнедеятельности )(
l
R и в процессе
C
обеспечения дополнительной энергией пластического обмена
c
)(
R :
C
k
l
c
l
С
С
С
RRRRR +=+= (3.12)
С
С
В соответствии с уравнением (3.1) :
l
β
C
1 SXCLXCLC
)/(/
EMMVxeMMVxeR ⋅⋅⋅⋅=⋅⋅⋅⋅=
(3.13)
В соответствии с уравнениями (3.1 и 3.3):
k
c
C
C
µ
µβ
1
)/(
EMMVxE
⋅⋅⋅⋅⋅
SXCLX
/
MMVxERR
=⋅⋅⋅⋅⋅==
XCLCX
(3.14)
В итоге, суммируя выражения (3.13) и (3.14), получаем
следующее уравнение для метаболической скорости
продуцирования углекислого газа:
M
( )
C
EeR ⋅⋅
µ
X
C
⋅⋅+=
ME
⋅
Vx
(3.15)
XS
L
Затраты аммиака определяются в соответствии с
уравнением (3.2):
N
2
NLN
57
µµβ
⋅⋅⋅⋅=⋅⋅⋅⋅=
MMVxcMMVxR //
(3.16)
XNLX
Скорость накопления биомассы определяется
(
)
⋅⋅+
⋅
µ
традиционной формулой:
VxVtxR ⋅⋅=⋅=
X
)/d(d (3.17)
µ
LL
Скорость расхода макроэргических соединений (в
пересчете на АТФ) в метаболизме поддержания
жизнедеятельности и в пластическом обмене, в соответствии с
уравнениями (3.1) и (3.2), равна:
M
ATF
( )
EeR ⋅⋅⋅⋅+=
µ
X
M
ATF
X
Vx
(3.18)
L
В условиях стационарного состояния биохимической
системы клетки (постоянства уровней внутриклеточных пулов
веществ, в том числе постоянства пула АТФ) скорость
образования АТФ равна скорости ее расхода.
Таким образом, все метаболические скорости могут быть
выражены через следующие неизвестные параметры: e и E
спериментальное определение состава биомассы,
Эк
.
X
величин двух любых метаболических скоростей позволяет,
используя уравнения (3.7), (3.11), (3.15) ÷ (3.18), найти
указанные неизвестные параметры и, следовательно, построить
полную стехиометрическую картину процесса наращивания
микробной биомассы.
Определение энергетических параметров и расчет
стехиометрии процесса роста на их основе. Для определения
энергетических параметров используем выражение
дыхательного коэффициента. Разделив величину R
величину R
(3.11), получим:
O
(3.15) на
C
C
e
E
⋅
S
==
RRRQ
/ (3.19)
O
4
γ
⋅
S
E
S
+⋅+
1
S
58
MEe
CX
E
X
−
E
S
M
⋅
⋅
µγγ
OX
Откуда, после преобразования, имеем:
γ
γ
−
⋅
EeF
µθ
/)( (3.20)
=+=
X
E
)(
XSS
RQMM
γ
−⋅⋅
)/(4
SOC
Полученная функция F(θ) линейна относительно
характерного времени развития популяции θ =1/µ = θ
(2)
θ
– период удвоения биомассы. Неизвестные величины затрат
(2)
/ln(2), где
макроэргических соединений на поддержание
жизнедеятельности (e) и процессы, связанные с ростом (E
),
X
могут быть найдены по графику, построенному по
экспериментальным данным.
Например, для штамма этанолокисляющих дрожжей
ndida lambica ВСБ-579 (формула биомассы СH
Ca
γ
= 4,4282; молекулярная масса с учетом зольных элементов M
X
1,8067N0,1662O0,44
X
= 24,74) соответствующие результаты, полученные при
проведении серии процессов с управлением непрерывной
подачей микродоз субстрата в режиме оксистата, представлены
в таблице 3.1 и на рис.3.1. В ходе процесса компьютер
стабилизировал расход отработанного воздуха на выходе
биореактора на уровне 4 нл/мин с погрешностью ±1,2%.
Значения удельной скорости роста, рассчитываемые по
динамике потребления кислорода, и дыхательного
коэффициента, усреднены на часовых интервалах. Процессы
проводились в условиях частичного лимитирования роста
микроорганизмов концентрацией субстрата. Это связано с тем,
что, при завершении потребления дозы субстрата, концентрация
растворенного кислорода начинает возрастать с некоторой
временной задержкой. В течение этого времени происходит
срабатывание внутриклеточных пулов питательных веществ, что
и влечет лимитирование субстратом в связи с «запоздалой»
реакцией дозирующей субстрат системы.
;
59
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]