Цитогенетический метод исследования
Используют для изучения нормального кариотипа человека,
а также при диагностике наследственных заболеваний, связанных с геномными и хромосомными мутациями.
Кроме того, этот метод применяют при исследовании мутагенного действия различных химических веществ, пестицидов, инсектицидов, лекарственных препаратов и др.
Подробное описание цитогенетического метода:
1) Для цитогенетического исследования достаточно 0,5 мл венозной крови.
2) Для культивирования во флакон с культуральной средой (с глутамином) и сывороткой крови (крупного рогатого скота) добавляют 0,5 мл исследуемой крови + антибиотик (гентамицин) + фитогемагглютинин (стимулирует митоз). Перемешивают, помещают в термостат на 72 часа (3 суток) при 37оС.
3) За 2 часа до фиксации добавляют колхицин. Непосредственно перед фиксацией клетки обрабатывают 0,56% раствором KCl при 37оС. Фиксацию производят смесью уксусной кислоты и метанола (1:3) в течение 60 минут. Далее на предметное стекло наносят 2 капли осадка, высушивают и окрашивают.
При дифференциальной G-окраске (по Гимзе) хромосомы предварительно обрабатывают протеазой.
Состав красителя Гимза: Метанол – 750 мл, Глицерин – 256 мл, Азур-1 – 3,772 г, Эозин – 2,165 г, Метиленовый синий – 1,563 г. Готовый жидкий краситель перед окрашиванием разводят из расчета 2 капли на 1 мл дистиллированной воды.
В 70-е годы ХХ века были разработаны методы дифференциального окрашивания хромосом человека, которые показали, что каждая пара хромосом имеет свой специфический характер чередования неокрашенных, светло- и темноокрашенных дисков (Парижская классификация хромосом человека). Разработка специальных методов окраски значительно упростила распознавание всех хромосом человека, а в совокупности с генеалогическим методом и методами клеточной и генной инженерии дала возможность соотносить гены с конкретными участками хромосом. Комплексное применение этих методов лежит в основе составления карт хромосом человека.
Необходимо отметить, что в диплоидных клетках человека 23 пары хромосом, из которых 22 пары аутосом и одна пара половых хромосом. Каждая метафазная хромосома имеет теломеры на концах и центромеру. По расположению центромеры хромосомы подразделяются на метацентрические (плечи равны по длине), субметацентрические (одно плечо несколько меньше) и акроцентрические (одно плечо значительно меньше, чем другое). Нумерация хромосом производится по размеру (самая крупная 1, самая маленькая 22).
Молекулярно-цитогенетический метод.
Основан на технологии флюоресцентной гибридизации in situ (FISH).
FISH-метод в зависимости от фазы клеток:
На интерфазных клетках.
На метафазных клетках - можно определять локализацию генов в хромосомах и все хромосомные аберрации (этапы соответствуют цитогенетическому методу + обработка зондом и гибридизация).
На клетках в стадию поздней профазы (вместо колхицина используют метотрексат).
FISH-метод в зависимости от типа мечения зонда:
А – прямое мечение (непосредственно к зонду присоединяют флюоресцентный краситель).
В – непрямое мечение (используется чаще, более чувствительная методика).
НЕПРЯМОЙ МЕТОД: Для исследуемой хромосомы или ее участка готовят однонитевой участок ДНК (ЗОНД), к которому присоединяют биотин и дигоксигенин. На микроскопическом препарате in situ денатурируют хромосомную ДНК щелочной обработкой, то есть разрывают связи между двумя цепочками ДНК. Препарат обрабатывают зондом. Так как последовательность нуклеотидов зонда и соответствующего участка исследуемой хромосомы комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК. Далее препарат обрабатывают стрептовидином (присоединяется к биотину) или антидигоксигениновым антителом (к дигоксигенину). К этим веществам присоединяют флюоресцентные красители (родамин - красный цвет или флюоресцеин - зеленый цвет).
Этапы FISH метода:
1. Конструирование зондов (размер не более 1000 п.н.).
2. Приготовление препарата метафазных хромосом (глава 1.4) или интерфазных ядер, фиксация на предметном стекле.
3. Денатурация ДНК (воздействие формамда при 70оС).
4. Добавление ДНК-зонда и гибридазация в течение 12 часов.
5. Отмывка, удаление негибридизировавших зондов.
6. Визуализация люминесцентным микроскопом.